طراحی و ساخت داربست نانو کامپوزیتی PLGA/Chitosan و ارزیابی تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی برروی آن جهت مهندسی بافت عصب

STUDENT

DEGREE

YEAR

In this study, nano-biocomposites composed of poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) and chitosan (CS) were electrospun using two different fabrication methods. In the single nozzle method, the CS nano-powders dispersed in PLGA solutions were electrospun through a single nozzle. In the double-nozzle method, PLGA and CS solutions were simultaneously electrospun from two different syringes and the electrospun PLGA nanofiber and electrosprayed CS nanoparticles were mixed and collected on the rotating drum to prepare the nano-biocomposite membrane. The PLGA/CS scaffolds were prepared at the different ratios of 90/10, 80/20, and 70/30 (w/w) %. In both methods were produced successfully randomly-oriented and aligned PLGA and PLGA/CS nanofibrous scaffolds. However, the single-nozzle method was associated with decreasing average fiber diameter of PLGA/CS nano-biocomposites when the CS content was increased. Moreover, the biocomposites fabricated by this method exhibited improved mechanical and hydrophilic properties in the evaluation of the scaffolds produced. The differentiation of human adipose derived stem cells (h-ADSCs) on artificial scaffolds is a critical issue in regeneration medicine. The Schwann cells (SCs) may be obtained from nerve biopsies for autologous tralantation. However, it is difficult to obtain sufficient amount of SCs for clinical applications. H-ADSCs can be induced to differentiate into Schwann-like cells (S-like cells) and used for autologous tralantation. In this study, tissue-engineered scaffold with chitosan nano-powders (CS) and poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) was investigated for its ability in the peripheral nerve regeneration in-vitro. The differentiation of h-ADSCs on PLGA/CS scaffolds produced Schwann cells. Six groups were compared for generating Schwann cells from ADSCs by considering the expression of several Schwann cell markers (GFAP, MBP and S100) using immunocytochemistry after differentiation. Schwann cell viability and morphology were investigated by the MTT assay and SEM micrographs. Moreover, the nano-chitosan promoted the formation of Schwann cells. However, the align orientation of nanofibers in scaffolds guided the differentiation of ADSCs towards Schwann cells in the constructs. Therefore, the combination of nano-chitosan and fiber alignment in PLGA/CS scaffolds can be promising in peripheral nerve regeneration.

در سال‌های اخیر با گسترش علم بین رشته‌ای مهندسی بافت که تلفیقی از به‌کارگیری روش‌های سلولی، مهندسی و علم مواد در ساخت بافت‌های زنده است، روزنه‌ی امیدی برای درمان و ترمیم ضایعات بافتی و نقص عضو پدید آمده است. با استفاده از این فناوری، سلول‌های ناحیه‌ای از بدن یا سلول‌های بنیادی را در محیط خارج بدن کشت داده و سپس مجتمع سلولی رشد کرده و یا تمایزیافته را وارد بدن فرد بیمار می‌کنند. در بیشتر مواقع، تکثیر و تمایز سلول‌ها بر روی بسترهایی صورت می‌گیرد که تقلیدی از ماتریکس خارج سلولی سلول‌های حیوانی است. این بسترهای مهندسی بافت از جنس پلیمرهای مصنوعی و طبیعی می‌باشند. پلی‌لاکتیک‌گلیکولیک‌اسید (PLGA) و کیتوزان به‌ترتیب از دسته‌ی پلیمرهای مصنوعی و طبیعی متداول برای کاربردهای مهندسی بافت هستند. در این پژوهش با استفاده از دو روش، داربست مهندسی بافت نانوبیوکامپوزیتی PLGA/CS تهیه شد. در روش اول نانوذرات کیتوزان تهیه‌شده به روش ژل‌شدن یونی در محلول پلیمری PLGA به‌صورت یکنواخت توزیع شده و به‌روش الکتروریسی تک مرحله‌ای با استفاده از یک سرنگ ریسیده شد. در روش دوم تهیه‌ی نانوذرات کیتوزان از محلول کیتوزان به‌روش الکترواسپری بهینه‌سازی شد و با استفاده از دو سرنگ به‌طور همزمان این نانوبیوکامپوزیت تهیه شد. در این روش، الکترواسپری نانوذرات کیتوزان بر روی نانوالیاف PLGA در حال جمع‌آوری بر روی درام به‌طور همزمان، نانوبیوکامپوزیتی یکنواخت حاصل ‌شد. این داربست‌ها با سه نسبت مختلف LGA/CS 30/70، 20/80 و 10/90 به هر دو روش با موفقیت ساخته شد. در همه نسبت‌های ذکرشده و به هر دو روش، الیافی با آرایش تصادفی و هم‌راستا تهیه شد و مشخصه‌های فیزیکی- شیمیایی داربست‌های تهیه‌شده به روش‌های مختلف ارزیابی شد. روش‌های مورد استفاده در مشخصه‌یابی داربست عبارت‌اند از: مشاهده مورفولوژی الیاف توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و همچنین میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، تعیین میزان جذب بافر فسفات () تحت عنوان نسبت تورم، تعیین زاویه‌ی تماس آب با سطح داربست، اندازه‌گیری خواص مکانیکی، زیست تخریب‌پذیری داربست در محیط بیولوژیکی خارج از بدن، طیف‌سنجی مادون قرمز (FTIR)، اسپکتروسکوپی فوتوالکترونی اشعه ایکس (XPS) و مطالعه‌ی خواص حرارتی داربست. نتایج حاصل شده در این بخش نشان داد در حالت بهینه، کمترین میانگین قطر الیاف در روش تک سرنگی و در داربست PLGA/CS با نسبت 30/70، معادل nm 286 در الیاف با آرایش هم‌راستا به‌دست آمد. درصد تورم این داربست به‌عنوان معیاری از آبدوستی برابر 10/11 ± 57/305 درصد و میزان تخریب نمونه در محیط بیولوژیک خارج از بدن در مدت یک ‌ماه 35-30 درصد حاصل شد. استحکام کششی، مدول یانگ و درصد ازدیاد طول به‌ترتیب برابر 19/1 ± 40/13 و 29/0 ± 00/3 مگاپاسکال و 8/1 ± 0/36 درصد برای این داربست به‌دست آمد. در بخش سلولی، پس از استخراج سلول‌های بنیادی از بافت چربی، این سلول‌ها جهت ارزیابی تمایزشان به سلول شوان استفاده شد. پس از ارزیابی سازگاری زیستی این سلول‌ها با داربست‌های تهیه‌شده، در ادامه تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول‌های شوان بر روی داربست‌ها با خواص بهینه مطالعه شد. سپس اثر پارامترهای مختلف بر رشد و تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی بررسی شد. پس از بهینه‌سازی نهایی خواص داربست و رشد و تکثیر و تمایز سلول‌ها بر روی آن، تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های شوان از نظر ایمونوسایتوشیمی اثبات شد و این محصول به‌عنوان فرآورده‌ی مهندسی بافت بهینه جهت ترمیم ضایعات اعصاب محیطی معرفی شد. روش‌های مورد استفاده در این بخش شامل بررسی میزان چسبندگی سلول‌ها به داربست، ارزیابی میزان بقاء سلول‌ها و تکثیر سلولی از طریق روش MTT و ارزیابی میزان سلول‌های تمایزیافته است. جهت بررسی درصد سلول‌های تمایزیافته به سلول‌های شوان از روش رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسنت مارکرهایGFAP، MBP، S100 استفاده شد و نتایج نشان داد بیشترین درصد بیان مارکرهای اختصاصی ذکرشده در داربست PLGA/CS تهیه‌شده به روش تک سرنگی با نسبت 30/70 با آرایش الیاف هم‌راستا به‌ترتیب برابر 5/89، 7/85 و 1/96 درصد حاصل شد. هر مرحله از آزمایش‌ها سه بار تکرار شد و آنالیز آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار -17 و تجزیه و تحلیل یافته‌ها با استفاده از روش ANOVA One Way انجام شد. این نتایج نشان داد که داربست‌های PLGA/CS با آرایش الیاف هم‌راستا قابلیت کاربرد وسیع جهت ترمیم و بازسازی اعصاب محیطی دارند.