بهبود استخراج کیتوزان حاصل از بیومس قارچ موکور ایندیکوس با استفاده از اسید لاکتیک

STUDENT

DEGREE

YEAR

: Chitin and chitosan are natural polymers consist of N-acetyl glucoseamine and glucosamine monomers. Chitosan, the deacetylated derivative of chitin, is more prefered compared with chitin because of superior properties like solubility in acidic solutions. Shellfish wastes are the most common source for producing chitin. An expensive deacetylation step is needed to produce chitosan from chitin which is isolated from shellfish wastes. Deacetylation process occurs naturally in the cell wall of some fungi; thus the cell wall of zygomycetes is becoming an alternative source of chitosan. Mucor indicus was chosen for the experiments. The most recent method suggested for chitosan extraction involves two step of sulfuric acid and lactic acid treatments, in which phosphate removal and chitosan dissolution occurs respectively. In this study, effects of different concentrations of sulfuric acid (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 M) on phosphate removal of cell wall were investigated. Also, effects of ultrasonication in the pretreatment stage was investigated. The yield of cell wall was measured to be 0.145 grams per gram of dried biomass. The amount of phosphate in the cell wall was measured to be 0.0456 grams per gram of cell wall. The maximum amount of phosphate removal was measured to be 81%, achieved by pretreatment with 0.2M sulfuric acid solution and 2.5 min ultrasonication. In this case, glucoseamine and N-acetyl glucoseamin content of remaining cell wall was 0.448 and 0.104 (grams per gram of cell wall), respectively. Results showed that 0.05M sulfuric acid solution has the best performance in phosphate removal toghether with preservation of chitosan in the cell wall. In this case, amount of glucoseamine in the remaining cell wall was measured to be 0.561 grams per gram of cell wall. Effects of 3 temperatures (0, 20 and 40 ?C) on the yield of chitosan extraction and viscosity of the product was also investigated. Results showed that conducting the extraction at 0 ?C results in 10% decrease in the intrinsic viscosity of the product. By the suggested process, the yield of 93% for shrimp chitosan was obtained. Decrease in the viscosity of extracted chitosan at 20 ?C and 40 ?C was 21% and 53% for low molecular weight chitosan and 12% and 37% for medium molecular weight chitosan respectively. Using extraction at 0 ?C, chitosan in the cell wall became insoluble in lactic acid solutio however, using ultrasonication step recovered its solubility. Finally, chitosan was extracted from the cell wall materials by pretreatment with 0.05M sulfuric acid and then treatment by lactic acid at 0?C and effect of ultrasonication time was investigated. Ultrasonication was done for 3, 5, 15, 30, and 60 min on phosphate-free cell wall at 0 ?C. Using the proposed method, the maximum yield of chitosan from the cell wall of Mucor indicus was 8.7%, achieved by 15 min ultrasonication. Keywords: Fungal chitosan, Mucor indicus , chitosan viscosity, phosphate removal, ultrasonication

کیتین و کیتوزان پلیمرهای طبیعی متشکل از مونومرهای گلوکزآمین و نرمال استیل گلوکزآمین هستند. کیتوزان فرم داستیله کیتین است و از حذف بخشی از گروه‌های استیل مونومرهای ساختاری کیتین به دست می‌آید. به دلیل برخی خواص مانند حلالیت کیتوزان در محلول اسیدهای رقیق مقبولیت این ماده نسبت به کیتین بیشتر است. کیتین به وفور در پوسته بدن سخت پوستان یافت می‌شود و طی یک مرحله استیل زدایی به کیتوزان تبدیل می‌شود. مرحله استیل زدایی به طور طبیعی در دیواره سلولی قارچ‌های زیگومایست نیز انجام می‌شود. اخیراً تلاش‌های بسیاری در جهت تولید کیتوزان از دیواره سلولی این خانواده از قارچ‌ها صورت گرفته است. در این پژوهش از قارچ موکور ایندیکوس استفاده شد که دیواره سلولی آن حاوی مقادیر مطلوبی از کیتوزان است. آخرین روش ارائه شده برای استخراج کیتوزان فرآیندی دومرحله‌ای با به کارگیری اسید سولفوریک و اسید لاکتیک است که به ترتیب وظیفه حذف فسفات از دیواره سلولی و جداسازی کیتوزان را بر عهده دارند. در این تحقیق ابتدا اثر غلظت‌های 025/0، 05/0، 1/0 و 2/0 مولار اسید سولفوریک در فسفات زدایی از دیواره سلولی مورد بررسی قرار گرفت. به طور همزمان تأثیر پیش فرآوری با اولتراسونیک بر میزان حذف فسفات نیز بررسی شد. دیواره سلولی قارچ 5/14 درصد وزن خشک قارچ را تشکیل می‌داد. میزان فسفات دیواره سلولی 0456/0 گرم بر گرم دیواره سلولی بود. بیشترین بازده حذف فسفات 81 درصد و طی پیش فرآوری با اسید سولفوریک 2/0 مولار و 5/2 دقیقه اولتراسونیک بدست آمد. در این شرایط مقدار گلوکزآمین و ان استیل گلوکزآمین موجود در دیواره سلولی باقیمانده به ترتیب 448/0 و 104/0 گرم بر گرم دیواره سلولی بود. بیشترین مقدار گلوکزآمین پس از پیش فرآوری با اسید سولفوریک 05/0 مولار 561/0 گرم بر گرم دیواره سلولی بود که نشان می‌دهد اسید سولفوریک 05/0 مولار تواناترین اسید در حفظ گلوکزآمین دیواره سلولی است. در ادامه تأثیر دما بر میزان کیتوزان استخراج شده و ویسکوزیته آن نیز بررسی شد. به دلیل پایین بودن بازده استخراج کیتوزان قارچی و از طرفی نیاز به مقادیر زیاد کیتوزان برای بررسی اثر پارامترها، از کیتوزان میگویی به عنوان مرجع استفاده شد. استخراج کیتوزان با اسید لاکتیک در دماهای صفر درجه سانتی گراد، محیط و 40 درجه سانتی گراد برای کیتوزان میگویی به کار گرفته شد و ویسکوزیته محصول اندازه‌گیری شد. نتایج بیانگر این بودند که کمترین مقدار کاهش ویسکوزیته 10 درصد است و طی فرآیند استخراج در دمای صفر درجه سانتی‌گراد رخ می‌دهد. در این دما حدود 93 درصد کیتوزان حل شده بازیابی شد. مقدار کاهش ویسکوزیته در دمای محیط و 40 درجه سانتی گراد به ترتیب 21 درصد و 53 درصد برای کیتوزان میگویی با وزن مولکولی کم و 12 درصد و 37 درصد برای کیتوزان با وزن مولکولی متوسط بود. با توجه به کاهش ناچیز جرم مولکولی در دمای صفر درجه سانتی گراد برای کیتوزان مرجع، فرآیند مشابه بر روی کیتوزان قارچی انجام شد. نتایج حاصل از آزمایشات نشان داد که در دمای صفر درجه سانتی گراد کیتوزان قابل توجهی از دیواره سلولی قارچ استخراج نمی‌شود. این مشکل با افزودن یک مرحله اولتراسونیک حین استخراج با اسید لاکتیک قابل رفع است. در ادامه مراحل پیش فرآوری با اسید سولفوریک رقیق و استخراج با اسید لاکتیک همزمان با فرآیند اولتراسونیک روی دیواره سلولی انجام شد. در این مرحله اثر زمان اولتراسونیک بر مقدار کیتوزان استخراج شده از قارچ نیز مورد بررسی قرار گرفت. دیواره سلولی عاری از فسفات برای زمانهای 3، 5، 15، 30 و 60 دقیقه در حمام اولتراسونیک با دمای صفر درجه سانتی گراد قرار داده شد. بیشترین بازده استخراج کیتوزان از دیواره سلولی قارچ موکور ایندیکوس 7/8 درصد در دمای صفر درجه سانتی‌گراد و پس از اولتراسونیک به مدت 15 دقیقه به دست آمد. واژگان کلیدی : کیتوزان قارچی، موکور ایندیکوس، ویسکوزیته کیتوزان، اولتراسونیک، فسفات زدایی