توالی یابی برخی از ژن های دخیل در سنتز آنتی اکسیدان ها و استفاده از آن ها در فیلوژنی جنس‌های مهم زیرخانواده Anthemideae

STUDENT

DEGREE

YEAR

Anthemideae is considered as an important subfamily of Asteraceae. In this subfamily, five genera have high economical and medicinal value, including: Achillea sp., Matricaria sp. Tanacetum sp., Artemisia sp. and Santolina sp. These plants possess bioactive compounds such as antioxidants. Antioxidants including two groups named as enzymatic and non-enzymatic. Plant antioxidants have fewer side effects compared to synthetic ones. As plants belonging to Anthemideae are rich for antioxidants, detection of genes involve in synthesis of these compounds is of great importance. In this study, four crucial antioxidant genes, aox2 (related to AOX or Alternative oxidase) and 3 other genes ( pal1 , pal2 and pal3 ) which were related to PAL (phenylallanin ammonia lyase), were detected in five genera of Anthemideae. According to Gene bank information and using OLIGO ver 5.0 software, specific primers were designed for these genera. aox2 , and pal2 had clear amplification, while for pal1 and pal3 no bands were observed. aox2 primers amplified a 300 bp fragment in all studied genera, while a 700 bp fragment could be observed from amplification of pal2 gene in Artemisia sp., Chrysanthemum sp., Matricaria sp. and Achillea sp. genera. The amplified fragments were sequenced and aligned with other plants in NCBI data base. The results obtained by BLAST search in NCBI database confirmed the correction of sequences. The results were also confirmed by multiple alignment of these genera with other plants, assessment of amino acid sequence in regards to their nucleotide sequence and the presence of the active region of PAL2 and AOX2 protein sequences. Nucleotide sequence, amino acid sequence and active domains assessment showed that these fragments were corresponding to pal2 and aox2 genes. We calculated parwise distance based on K2P, p-distance model and genetic diversity based on transition and transversion to investigate the intergenus variation among some important genus of Anthemideae. Average pairwise distance was also calculated between studied genera and Artemisia annua and other genera of Asteraceae family. Calculating the Pairwise distance based on K2P ( aox2 = 0.069, pal2 = 0.177) and P-distance ( aox2 = 0.059, pal2 = 0.156) and genetic diversity based on transition and transversion ( aox2 = 14.5%, pal2 = 30.2%) indicated that these genera were more conserved based on aox2 gene, while pal2 showed more diversity. According to pairwise distance results, Matricaria sp. and Achillea sp . were the closest genera while Artemisia sp. and chrysanthemum sp . had the most distance which was in agreement with results of ndhf choloroplastic gene. Pal2 region had low diversity in compare to aox2 region. Dendrogram was plotted using the maximum parsimony for aox2 gene was similar to result which created in cluster analysis with ndhf gene and ITS sequence that can be due to high similarity of mentioned genus in aox2 gene. Keywords: Antioxidants, Anthemideae,

یکی از زیر خانواده های مهم در خانواده Asteraceae، زیرخانواده Anthemideae می باشد. در این زیرخانواده 5 جنس با اهمیت که شامل بومادران (. Achillea sp)، بابونه ( Matricaria sp.)، مخلصه ( Tanacetum sp.)، درمنه ( Artemisia sp. ) و Santolina sp. وجود دارند که اغلب به عنوان گیاهان دارویی مهم در پزشکی مطرح می باشند. این گیاهان دارای ترکیبات فعالی از جمله آنتی اکسیدان ها می باشند که آنان را از اثرات مضر گونه های واکنشگر اکسیژنی (ROS) حفظ می‌نمایند. آنتی اکسیدان ها به دو گروه کلی آنزیمی و غیر آنزیمی تقسیم می شوند. به طور کلی آنتی اکسیدان های گیاهی نسبت به آنتی اکسیدان های سنتز شده به صورت شیمیایی عوارض کمتری دارند. از آن جایی که گیاهان دارویی زیرخانواده Anthemideae، منبع غنی از آنتی اکسیدان های گیاهی می باشند، شناسایی و ردیابی توالی ژن های آنتی‌اکسیدان در این زیرخانواده ضروری به نظر می رسد. به همین منظور در این پژوهش، چهار ژن مهم دخیل در سنتز آنتی اکسیدان ها مورد بررسی قرار گرفت. یکی از این ژن ها aox 2 کد کننده ی یکی از زیرواحدهای آنزیم Alternative oxidase یا AOX است و سه ژن دیگر ( pal 1 ، pal 2 و pal 3 ) مربوط به آنزیم Phenylalanin ammonia lyase یا PAL می باشند. در این مطالعه، ابتدا براساس همردیف سازی چندتایی توالی های جستجو شده در پایگاه داده های بانک ژن، آغازگرهای اختصاصی طراحی و سپس تکثیر آن ها در 5 جنس مذکور بررسی شد. پس از انجام واکنش PCR مشخص گردید که دو آغازگر مربوط به ژن های aox 2 و pal 2 نوار موردنظر را به طور واضح تکثیر نمودند اما آغازگرهای مربوط به ژن pal 1 و pal 3 تکثیر مناسبی در جنس های مدنظر نشان ندادند. آغازگر مربوط به ژن aox 2 در تمام جنس های مذکور ناحیه ای به طول تقریبی 300 جفت نوکلئوتید را تکثیر نمود درحالیکه آغازگر مربوط به ژن pal 2 ناحیه ای در حدود 700 جفت نوکلئوتید را در جنس های Artemisia sp.، Chrysanthemum sp. ، Matricaria sp. و Achillea sp. تکثیر کرد. نتایج حاصل از جستجو با ابزار BLAST در پایگاه داده های NCBI برای توالی های بدست آمده، صحت توالی های مذکور را تأیید نمود. همردیف سازی چندتایی توالی ژن های aox 2 و pal 2 با توالی های همتای خود در سایر گیاهان موجود در پایگاه داده های NCBI و نیز بررسی توالی های آمینو اسیدی بدست آمده از توالی های نوکلئوتیدی ژن های مذکور و حضور ناحیه فعال پروتئینی در این توالی ها، تأیید دیگری بر صحت توالی های بدست آمده بود. به منظور بررسی تنوع بین جنس های مهم زیرخانواده Anthemideae برای هر کدام از ژن های aox 2 و pal 2 به صورت جداگانه میانگین کل Pairwise distance بر اساس دو مدل K2P، P-diatance و نیز درصد تنوع بر مبنای جایگزینی های همجنس و ناهمجنس محاسبه گردید. به منظور توجیه داده های بدست آمده، میانگین کل Pairwise distance و درصد تنوع بر مبنای جایگزینی‌های همجنس و ناهمجنس بین سایر خانواده های گیاهی نیز محاسبه گردید. نتایج حاصل از آنالیز سایر خانواده‌های گیاهی با نتایج حاصل از بررسی ژن های aox 2 و pal 2 در زیرخانواده Anthemideae همسو بود. همچنین داده های حاصل از محاسبه میانگین کل Pairwise-distance بر اساس دو مدل K2P ( aox 2 = 069/0، pal 2 = 177/0)، ‌P-diatance ( aox 2 = 059/0، pal 2 = 156/0) و نیز درصد تنوع بر مبنای جایگزینی های همجنس و ناهمجنس ( aox 2 = 5/14%، pal 2 = 2/30% ) نشان داد که جنس های مذکور از نظر ژن aox 2 حفاظت شده تر می باشند در حالیکه از نظر ژن pal 2 تنوع بیشتری دارند. نتایج حاصل از بررسی فاصله دوتایی (Pairwise-distance) توالی ها برای هرکدام از ژن های aox 2 و pal 2 نشان داد که جنس های Matricaria sp. و Achillea sp. نزدیکترین جنس ها به یکدیگر و جنس‌های Artemisia sp. و Chrysanthemum sp. دورترین جنس ها از یکدیگر محسوب می شوند که این داده ها با نتایج بدست آمده توسط ژن کلروپلاستی ndhf همسو است. نتایج حاصل از ترسیم نمودار خوشه ای برای ژن aox 2 با استفاده از ضریبMaximum parsimony، با نتایج حاصل از نمودار خوشه ای رسم شده توسط ژن کلروپلاستی ndhf و نشانگر ITS مطابقت داشت و این به دلیل شباهت بیشتر جنس های مذکور از نظر ژن aox 2 می باشد. کلمات کلیدی: آنتی اکسیدان ها، زیرخانواده Anthemideae ، pal 2 ، aox 2