Skip to main content
SUPERVISOR
بدرالدین ابراهیم سیدطباطبایی (استاد راهنما) سیروس قبادی (استاد راهنما) حمید رجبی معماری (استاد مشاور)
 
STUDENT
Majedeh Neisi
ماجده نیسی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1390

TITLE

Transformation of Hepatitis B Virus surface antigen gene into pepper plant (Capsicum annuum L.).
The Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the most viral infections of humans and causes acute and chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. The effective way to treatment and prevention of the disease is vaccination. Since the chemical drugs are very expensive, so in recent years the transgenic plants as an alternative bioreactors for the production of cheap, mass and safety, and delivery of various recombinant biopharmaceutical compounds and many kind of therapeutic recombinant proteins, have been interest to many researchers. The HBsAg produced in transgenic plants is antigenically and physically similar to the HBsAg particles derived from human serum and recombinant yeast, which are used as vaccines. In this study, Hepatitis B surface antigen gene ( HBsAg ) was transferred in pepper plants that have special significance the area under cultivation, nutritional and medicinal value of horticultural products. First, the sequence of HBsAg gene was idenified by NCBI database. For amplification of the target gene by polymerase chain reaction, specific primers were designed by oligo analyser software. Then, to increase the number of pCAMBIA plasmid containing HBsAg gene and easy access to it in emergency condition, cloning was done i E. coli JM107. To produce the transgenic plants containing, the plasmid containing HBsAg gene transferred to Agrobacterium tumefaciens. First for of callus induction and plant regeneration of pepper plant in the success transfer of HBsAg gene to ultra plant, tissue culture conditions were optimized in order to select the best explant and hormon mixture. Then the target gene was transferred to pepper plant by Agrobacterium-mediated. The results of the optimization of tissue culture show that 5mg.l -1 BAP + 1mg.l -1 IAA for callus induction and 3mg.l -1 BAP + 1mg.l -1 IAA are suitable for regeneration. Cotyledon explants from 2-3 week-old seedlings are the best selected explants and the appropriate age inoculated with Agrobacterium containing pCAMBIA-HBsAg. To select transgenic plants, the best concentration of selectivity antibiotic Hygromycin, was diagnosed 10 mg.l -1 . In addition, use of 3mg.l -1 Zea stimulate the growth of buds were gehy;erated from the transformed callus and escalated shooting. To induce elongation and inhibition of rosette plants, 2mg.l -1 BAP GA 3 were used inculture medium. Transfer The regenerated shoots to medium containing coal, be caused their rooting after 4-6 weeks. After the suitable growth of pepper plantlets (about 15 cm), they were transferred to situation in vivo (pots). PCR reactions showed that there is at least one copy of the HBsAg gene in transgenic pepper plants. The results of RT-PCR reactions confirmed that the gene is expressed in transgenic pepper. These results indicate that the first step to production of edible vaccine against Hepatitis B by produce recombinant proteins in a plant bioreactor of pepper is properly removed.
هپاتیت ‌B، یکی از شایع‌ترین عفونت های ویروسی است که عامل ایجاد هپاتیت مزمن، حاد و سرطان کبد در انسان می باشد. امروزه بهترین و مناسب‌ترین راه درمان و پیشگیری از این بیماری، واکسیناسیون است؛ به‌سبب هزینه گزاف داروهای شیمیایی، در سال های اخیر گیاهان به عنوان بیورآکتورهای مناسب برای تولید ارزان، انبوه و همچنین ایمنی ترکیبات دارویی و نوترکیب مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته اند. آنتی ژن سطحی هپاتیت B تولید شده در گیاهان تراریخت از نظر صفات آنتی ژنی و فیزیکی شباهت بسیاری به ذرات HBsAg مشتق شده از سرم انسانی و مخمر نوترکیبی دارد که تاکنون به عنوان واکسن استفاده شده اند. در این تحقیق، جهت تولید گیاهان تراریخت حامل ژن HBsAg ، از ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت B ( HBsAg ) برای انتقال به گیاه فلفل دلمه ای که دارای اهمیت ویژه ای از نظر سطح زیرکشت، ارزش تغذیه ای و دارویی در بین سبزی ها می باشد، استفاده گردید. به این منظور ناقل پلاسمیدی pCAMBIA حاوی ژن HBsAg در باکتری مستعد E. coli نژاد JM107 همسانه‌سازی وسپس به باکتری Agrobacterium tumefaciens نژاد LBA4404 منتقل گردید. انتخاب ریز نمونه از برگ های لپه ای (کوتیلدون) فلفل دلمه ای و همچنین ترکیب هورمونی محیط کشتMS برای انتفال موفقیت آمیز ژن HBsAg درکشت درون شیشه ای بهینه گردید. سپس ژن HBsAg با واسطه‌گری آگروباکتریوم حاوی دستواره pCAMBIA – HBsAg به گیاهان فلفل دلمه ای منتقل شد. نتایج حاصل از بهینه‌سازی کشت بافت نشان داد که ترکیب هورمونی یک میلی‌گرم در لیتر IAA به همراه پنج‌ میلی‌گرم در لیتر BAP برای کالوس زایی و ترکیب هورمونی یک میلی‌گرم در لیتر IAA با سه‌ میلی‌گرم در لیتر BAP برای باززایی ریز نمونه کوتیلدون (برگ های لپه ای) بذور فلفل دلمه ای دو هفته پس از کشت روی محیط M مناسب می‌باشد. علاوه بر این استفاده از هورمون Zea در غلظت سه‌ میلی گرم در لیتر، و جیبرلین در غلظت دو میلی‌گرم در لیتر در محیط کشت باعث تحریک باززایی شاخساره ها از کالوس و طویل شدن طول آن ها شد. پس از چهار تا شش هفته، گیاهچه های تراریخت شده در محیط کشت M حاوی یک میلی گرم در لیتر NAA و 4/0 در صد زغال فعال ، ریشه‌دار و بعد از رشد مناسب در شرایط In vitro (ارتفاع حدود 10 سانتی متر)، به گلدان منتقل شد. نتایج واکنش های PCR و تکنیک RT-PCR با استفاده از آغازگر اختصاصی ژن HBsAg ، انتقال پایدار ژن HBsAg توسط آگروباکتریوم و همچنین بیان آن در گیاه فلفل دلمه ای را تأیید نمود. کلمات کلیدی: انتقال ژن، اگروباکتریوم، آنتی ژن سطحی هپاتیت B، فلفل دلمه‌ای، واکسن خوراکی

ارتقاء امنیت وب با وف بومی