بیش بیان ژن کدکننده آنزیم HMG-CoA ردوکتاز به منظور افزایش تولید هترولوگ لینالول در مخمر ساکارومایسس سرویزیه

STUDENT

DEGREE

YEAR

Terpenoids are a group of secondary metabolites that usually exist in herbal tissues as the main components of essential oils. Due to their wide use in pharmaceutics, cosmetics, and food industry these compounds have attracted great attention recently. Saccharomyces cerevisiae naturally contains the necessary precursors for the synthesis of terpenoids and therefore can be used as a cell factory for heterologous production of these compounds. However, major portion of the available isopenthenyl pyrophosphate (IPP), as the main precursor for the biosynthesis of terpenoids, in the cell is consumed for the synthesis of ergosterol (the final product of mevalonate pathway). Therefore, the lack of free IPP in the cell limits the amount of the heterologous production of terpenoids in the cells. To increase the amount of free IPP in the cell the key enzymes in the mevalonate pathway need to be regulated. HMG-COA reductase, is one of the key enzymes in the mevalonate pathwaywhich catalyzes a limiting step in the pathway. Overexpression of HMG1 which encodes this enzyme is expected to improve the available IPP for the biosynthesis of terpenoids. By downregulation of ERG9 (encoding squalene synthase) it is also possible to reduce the flux of IPP towards ergosterol. Linalool is an acyclic aromatic monoterpene which exists in many plants. This monoterpen can be used in cosmetics and hygienic products and also treatment of diseases such as breast cancer and leukemia The aim of the current study was to examine the influence of overexpression of HMG1 catalytic domain and repressiom of ERG9 and therefore obtaining a yeast strain with high linalool production ability. To this end, HMG1 catalytic domain was cloned in pESC-URA expression vector under the control of GAL10 promoter. Then by cloning linalool synthase gene ( LIS ) through gap repair technique in the vector, pESC-URA-HMG1-LIS construct was obtained. As a control, pESC-URA -LIS vector was also constructed. By transforming these vectors into wild type yeast (CEN.PK 113-5D) and ERG9 downregulated yeast strain, 5D- pESC-LIS, 5D- pESC- HMG-LIS, ERG9- pESC-LIS and ERG9- pESC - HMG-LIS strains were constructed. After extracting linalool from culture medium by using solid phase extraction (SPE) method, the amount of the linalool was determined by analyzing with gas chromatography (GC). Overexpression of HMG1 doubled the amount of linalool in 5D- pESC- HMG-LIS compared to 5D- pESC-LIS. However, overexpression of HMG1 in the ERG9- pESC-LIS strain did not improve the amount of the linalool synthesis which is likely due to the activation of the feedback inhibition and production of byproducts following ERG9 repression. Therefore, ERG9-pESC-LIS and 5D- pESC- HMG-LIS produced the highest amounts of linalool. Repression of ERG9 also improved linalool production by three-fold.These observations indicate that by manipulating the key enzyme in the mevalonate pathway, it is possible to construct linalool overproducer yeast strains.

ترپنوئید ها دسته ای متنوعی از متابولیت های ثانویه هستند که بیش تر در بافت های گیاهی به عنوان جزء اصلی روغن hy;های ضروری یافت می شوند. به دلیل کاربرد گسترده این ترکیبات در صنایع دارویی، آرایشی و غذایی تولید میکروبی این ترکیبات اخیرا بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مخمر ساکارومایسس سرویزیه به دلیل وجود مسیر موالونات به طور طبیعی حاوی پیش ماده ضروری سنتز ترپنوئید ها (IPP ) است و از این رو پتانسیل تولید بسیاری از ترپنوئید ها را دارد. اما به دلیل اختصاص قسمت اعظم IPP موجود در سلول به سنتز ارگوسترول (محصول نهایی مسیر موالونات) و بنابراین کمبود IPP آزاد درون سلولی ، بیان دگر ساخت ترپنوئید ها به سنتز مقدار بسیار کمی از آنها در سلول های مخمر می انجامد. افزایش IPP آزاد درون سلولی عمدتا از طریق افزایش فعالیت آنزیم های کلیدی موجود در مسیر و جلوگیری از مصرف آن در راه تولید ارگوسترول میسر می شود. آنزیم HMG-COA ردوکتاز یکی از آنزیم های کلیدی مسیر موالونات است و بنابراین بالا رفتن میزان آن درسلول می تواند یکی از راهکار های افزایش IPP باشد. از سوی دیگر مهار ژن ERG 9 (کد کننده آنزیم اسکوالن) از طریق کاهش پیش ساز سنتز ارگوسترول، مانع از تخصیص IPPهای موجود در سلول جهت سنتز ارگوسترول می گردد و بدین ترتیب محتوی IPP آزاد درون سلول را بالا می برد. لینالول یک مونوترپنوئید غیر حلقوی معطراست که در بسیاری از گیاهان گلدار و گونه های گیاهی یافت می شود. این مونوترپنوئید علاوه بر کاربرد در صنایع آرایشی و بهداشتی در درمان بیماریهایی مثل لوسمی و سرطان سینه نیز به کار می رود. هدف از این تحقیق تعیین اثر بیش بیان قسمت کاتالیتیک ژن HMG 1 ( ژن کد کننده آنزیم HMG-COA ردوکتاز) و مهار ژن ERG 9 بر روی تولید لینالول و از این طریق دستیابی به سویه ای مخمری باقابلیت تولید بالای لینالول است. در اجرای این تحقیق ابتدا قسمت کاتالیتیک ژن HMG 1 ( tHMG 1 ) تحت کنترل پروموتور GAL10 در ناقل بیانی pESC-URA همسانه سازی شد. پس از آن با همسانه سازی ژن لینالول سنتاز ( LIS ) با استفاده از تکنیک Gap repair در ناقل مذکور، سازواره pESCURA-HMG-LIS ایجادگردید. به منظور بررسی اثر بیش بیان ژن tHMG 1 سازواره pESCURA -LIS نیز ساخته شد. انتقال این دو سازواره به دو سویه ERg9 و 5D منجر به ایجاد 4 سویه 5D- pESC-LIS، 5D- pESC- HMG-LIS، ERG9- pESC-LIS، ERG9- pESC - HMG-LIS گردید. جهت یافتن زمان مناسب برای نمونه برداری و استخراج لینالول تولید شده در کشت سلولی مورد استفاده، منحنی رشد سویه های موجود رسم شد. پس از استخراج لینالول با استفاده از روش استخراج فاز جامد، میزان سنتز لینالول طی آنالیزکروماتوگرافی گازی ( GC ) محاسبه گردید. بیش بیان ژن tHMG 1 از طریق بالابردن میزان IPP موجود در سلول و به بیان دیگر رفع محدودیت کمبود IPP در سلول ، باعث بالا دو برابر شدن میزان سنتز لینالول در 5D- pESC- HMG-LIS نسبت به سویه 5D- pESC-LIS شد. مشاهده میزان لینالول تولیدی توسط دو سویه ERG9- pESC-LIS و ERG9- pESC - HMG-LIS نشان می دهد که بیش بیان ژن tHMG 1 تغییر چندانی درمیزان سنتز لینالول ایجاد نکرد که احتمالا ناشی ازفعال شدن سیستم تنظیم بازخوری سلول و تولید ترکیبات جانبی به دنبال مهار ژن ERG 9 است . به طور کلی مقایسه غلظت لینالول در سویه های موجود نشان داد که در دو سویه ERG9- pESC-LIS، ERG9- pESC - HMG-LIS سنتز لینالول به مراتب بالاتر از دو سویه دیگر است . این مشاهدات بیانگر این است که کاهش تخصیص IPP های درون سلولی جهت سنتز ارگوسترول وتغییر مسیر متابولیسمی به سمت سنتز لینالول تأثیر بیشتری را نسبت به بیش بیان ژن tHMG 1 روی تولید این ترکیب اعمال کرده است. مهار ژن ERG 9 به تنهایی موجب سه برابر شدن سنتز لینالول در سلول های مخمر شد.