ردیابی و آنالیز بیان ژن‌های کلیدی دخیل در مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین در ارقام مختلف سیب‌زمینی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Potato ( Solanumtuberosum ) as a major source of starch, protein, antioxidants and vitamins, is one of the most nutritious crops in the world. An important physiological aspect of potato is the anthocyanin compounds in its tuber. Anthocyanins are protective against pests and pathogens, attractive for pollinators and have role in signaling of plant-microbe interaction. The variation of anthocyanin contents in specific tissues induces the tuber color into red, blue and purple. Anthocyanins also reduce the risk of human cancer by their antioxidant activity to prevent the free radicals action. There are two groups of genes involved in anthocyanin biosynthetic pathway in plants. Of which, structural genes such as chs, chi, ans and uf3gt code for necessary enzymes in pigment biosynthesis process and the second group, as transcription factors, regulates the function of structural genes. Due to lack of detailed information about the function of structural genes in anthocyanin biosynthetic pathway in potato plant, the present research focused on detection and expression analysis of chs, chi, ans and uf3gt genes in tuber skin and flesh tissue of different potato cultivars with various tuber colors. To detect the corresponding genes in the cultivars, the PCR reaction was performed using specific primer pairs designed from conserved sequences of the genes in the NCBI database. The amplification of DNA bands with expected sizes in PCR reactions documented the presence of analogous gene in tested potato cultivars. The detection of anthocyanin pathway genes in potatoes was verified by restriction enzyme analysis and nucleotide sequencing of the amplified fragments. The sequence analysis revealed that the chs, chi, ans and uf3gt genes detected in the potato cultivars are homologus and similar to those previously sequenced and deposited in NCBI database. The RNA extraction and cDNA synthesis from the tuber skin and flesh tissues of the potatoes were done and the expression of each gene was analyzed in common RT-PCR and Real-time PCR reactions. In the expression analysis, chs , ans and uf3gt genes were successfully amplified, whereas chi gene failed to produce the expected fragment. Based on the results of Real-time PCR reaction, chs , ans and uf3gt were differently expressed in tuber skin and flesh tissues of the cultivars examined. In both skin and flesh tissues of the red and purple tubers, the expression level of these genes was significantly (p 0.05) higher than white cultivars. Accordingly, the anthocyanin content of colored potatoes was significantly (p 0.05) higher than white tubers. The restriction enzyme analysis and nucleotide sequencing validated the specific amplification of each isoform in the tubers and the RT-PCR results revealed that both isoforms are expressed simultaneously to direct anthocyanin biosynthesis in colored potato tubers. Based on the Real-time PCR and anthocyanin extraction results, it can be concluded that the coloration and anthocyanin contents of potato tubers is correlated to the expression of chs , ans and uf3gt genes. The results indicated that chs , ans and uf3gt are the key genes in anthocyanin biosynthesis pathway of colored potato cultivars; while chi does not seem to have a crucial role in anthocyanin biosynthesis process. Keywords: Potato, Anthocyanin, Gene detection, Gene expression analysis, Real-time PCR

سیب‌زمینی ( Solanumtuberosum )متعلق به خانواده Solanaceae، به دلیل دارا بودن منابع مهم نشاسته، پروتئین، آنتی اکسیدان و ویتامین، یکی از محصولات مهم اقتصادی و مغذی در جهان محسوب می شود. یکی از ویژگی‌های مهم فیزیولوژیکی سیب‌زمینی محتوای آنتوسیانین موجود در غده‌های آن است. تنوع طبیعی رنگ غده سیب‌زمینی از تفاوت میزان تجمع آنتوسیانین‌ها در بافت‌های اختصاصی آن سرچشمه می‌گیرد. آنتوسیانین‌ها به عنوان رنگدانه های اصلی گیاه شناخته می‌شوند و عامل ایجاد کننده رنگ قرمز، آبی و بنفش هستند. آنتوسیانین‌های گیاهی در حفاظت میزبان در مقابل آفات و عوامل دیگر، جلب گرده افشان ها و سیگنال‌دهی در رابطه میکروب-گیاه دخالت دارند. علاوه بر این، آنتوسیانین‌ها با جلوگیری از فعالیت رادیکال های آزاد، خصوصیات آنتی‌اکسیدانی قابل توجهی را نشان می‌دهند و مصرف آن ها در رژیم غذایی سبب کاهش بیماری هایی نظیر سرطان می گردد. در مسیر بیوسنتز آنتوسیانین های گیاهی دو دسته از ژن ها دخالت دارند. دسته اول ژن های ساختاری این مسیر هستند که آنزیم های مورد نیاز برای بیوسنتز رنگدانه ها را کد می کنند. گروه دوم ژن ها، عوامل رونویسی هستند که وظیفه تنظیم ژن های ساختاری را بر عهده دارند.ژن های chs ، chi ، ans و uf3gt از جمله ژن های ساختاری موثر در مسیر بیوسنتز آنتوسیانین هستند. با توجه به این که اطلاعات در مورد کارکرد ژن های ساختاری مسیر بیوسنتز آنتوسیانین در گیاه سیب زمینی محدود است، هدف این تحقیق ردیابی، آنالیز بیان ژن های chs ، chi ، ans و uf3gt در سیب زمینی و مقایسه میزان بیان آن ها با میزان تولید آنتوسیانین در بافت های پوست و گوشت غده ارقام مختلف سیب زمینی با رنگ غده متفاوت انتخاب شد. بدین منظور، ابتدا به کمک توالی های شناخته شده از ژن های مزبور در بانک اطلاعاتی NCBIو از روی مناطق حفاظت شده، جفت آغازگرهای اختصاصی برای ردیابی هر کدام از ژن های مزبور طراحی شد. سپس، عملیات ردیابی هر یک از ژن ها با انجام واکنش PCRبر روی DNAژنومی ارقام مختلف سیب زمینی با رنگ غده متفاوت انجام گرفت. الکتروفورز محصول واکنش ها بر روی ژل آگارز تکثیر اختصاصی قطعات مورد انتظار برای هر یک از چهار ژن مورد بررسی را درDNAژنومی ارقام سیب زمینی با رنگ غده متفاوت اعم از سفید، قرمز و بنفش نشان داد. برش آنزیمی و نیز توالی یابی نوکلئوتیدی این قطعات در ارقام مختلف با رنگ غده متفاوت، صحت ردیابی ژن های مزبور را تایید کرد. پس از مقایسه توالی های بدست آمده از ارقام مختلف با همدیگر و با توالی های موجود در بانک اطلاعاتیNCBI،مشخص گردید که توالی ها شباهت زیادی با هم و با توالی های شناخته شده قبلی دارند، هر چند تفاوت هایی نیز در سطح نوکلئوتیدی در بین ارقام مختلف دیده شد. پس از ردیابی موفق ژن ها، استخراج RNA و سنتز cDNA از بافت های پوست و گوشت غده ارقام مختلف سیب زمینی در مراحل انتهایی رشد آن هاصورت گرفت و بیان هر ژن در واکنش های RT-PCRمعمول وReal-time PCRآنالیز شد. در آنالیز بیان ژن chi با استفاده از واکنش RT-PCR،درcDNAمخلوط پوست و گوشت غده تکثیری صورت نگرفت، ولی ژن های chs ، ans و uf3gt تکثیر شدند. با توجه به این نتایج، واکنش Real-time PCRبر روی ژن های chs ، ans و uf3gt انجام گرفت و مشخص گردید که بیان این ژن ها در بین بافت های پوست و گوشت غده ارقام مختلف متفاوت است.نتایج نشان داد که در بافت های رنگی قرمز و بنفش (صرف نظر از نوع بافت پوست و یا گوشت غده)، میزان بیان ژن های مزبور به صورت معناداری (p 0.05)از بافت های سفید رنگ بالاتر است. استخراج آنتوسیانین از بافت های پوست و گوشت غده ارقام مختلف نشان داد که بافت های بنفش و قرمز رنگ میزان آنتوسیانین بیشتری نسبت به بافت های سفید رنگ دارند و این تفاوت معنی دار است(p 0.05). در تحقیق حاضر، همچنین با طراحی و استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی، ایزوفرم های 1( Stchs1a , Stchs1b ) و 2( Stchs2 )ژن chs در واکنشRT-PCRدر بافت های پوست و گوشت غده ارقامی که بیشترین بیان از ژن chs را داشتند، به صورت اختصاصی تکثیر شد و صحت تکثیر اختصاصی هر یک از آن ها به کمک برش آنزیمی و توالی یابی نوکلئوتیدی تایید گردید. نتایج نشان داد که هر دو ایزوفرم این ژن در بافت های رنگی پوست و گوشت غده به صورت همزمان در حال بیان هستند و بیان آن ها با بیوسنتز آنتوسیانین ارتباط دارد.مقایسه نتایجReal-time PCRو استخراج آنتوسیانین مشخص کرد که بیان هماهنگ هر سه ژن chs ، ans و uf3gt با میزان آنتوسیانین و رنگ بافت در ارتباط است و این ژن ها نقشی کلیدی در بیوسنتز آنتوسیانین در غده ارقام رنگی سیب زمینی بر عهده دارند، در صورتی که به نظر نمی رسد ژن chi در سنتز آنتوسیانین در غده نقش حیاتی داشته باشد. کلمات کلیدی: سیب زمینی، آنتوسیانین، ردیابی ژن، آنالیز بیان ژن،Real-time PCR