Skip to main content
SUPERVISOR
آذر شاه پیری (استاد راهنما) اصغر طاهری کفرانی (استاد مشاور)
 
STUDENT
Tahere Shariari farfani
طاهره شهریاری فارفانی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1393
?-lactoglobulin (BLG) is a member of lipocalin superfamily of traorters for small hydrophobic molecules such as retinoids, fatty acids, drugs and vitamins. BLG structure has 2 intramolecular disulfide bonds and one free cystein in cys121. BLG is one of the major bovine milk allergen that disulfide bonds are responsible for bovine milk allergy and low digestibility. It seems that the digestibility of BLG will be increased via the reduction of disulfide bonds. The reducing agents such as DTT is able to reduce disulfide bonds and increase the the BLG digestibility. However due to the toxic effect of DTT, the use of this agent is not applicable. Therefore, this can be substituted by natural enzymes. In the present study, we aim to study the effect of plant thioredoxin systems on the digestibility of milk BLG. Thioredoxins (Trxs) are small and abundant disulfide reductase in all organisms. Trxs are characterized with WC (G/P) PC in active site. Trxs are reduced themselves with NADPH via NADPH-dependent thioredoxin reductase (NTR). Previously the genes encoding three rice Trx, OsTrx1, OsTrx20 and OsTrx23 and the gene encoding OsNTR1were cloned and heterologously expressed in E.coli . In this study these proteins were produced and purified in considerable amounts. The activity of Trxs was confirmed by insulin assay. Moreover, the interaction of OsNTR1 with each of OsTrxs was performed using DTNB assay. The result of this assay showed that OsNTR1 was able to reduce OsTrx1 and OsTrx23. However, OsTrx20 was not reduced by OsNTR1. Instead this isoform was reduced by glutathione (GSH). The isoform OsTrx1 can also be reduced by GSH. Therefore, in this study the effect of four systems OsNTR1/OsTrx23, OsNTR1/OsTrx1, GSH/OsTrx20, GSH/OsTrx1 on the digestibility of BLG was studied. To this end BLG was pre-treated by these systems at 4, 25, 37 and 55 °C and then digested with trypsin. The digestability was studied using SDS-PAGE and HPLC. The results revealed that different Trx system significantly affect on the BLG digestability. However, there was no significant difference between the effect of different systems. In addition, the results show that Trx systems work in 4, 25 and 37 °C. Nevertheless, these systems were not affected at 55 C which could be due to the unstability of NTR in this temperature. Key words: NTR/Trx system, glutathione, beta lactoglobulin, digestibility, trypsin, reverse phase -liquid chromatography
بتالاکتوگلوبولین (BLG) یکی از اعضای ابر خانواده لیپوکالین ها است؛ که نقش انتقال دهنده مولکول های هیدروفوب کوچک از قبیل رتینوئیدها، اسیدهای چرب، داروها و ویتامین ها را بر عهده دارد. در ساختار BLG دو پیوند دی سولفیدی و یک سیستئین آزاد در موقعیت 121 وجود دارد. وجود باند های دی سولفیدی در BLG دلیل هضم پذیری کم این پروتئین در سیستم های گوارشی جانوران و همچنین آلرژی زایی این پروتئین می باشد. به نظر می رسد استفاده از احیا کننده هایی که بتوانند باندهای دی سولفیدی موجود در این پروتئین را احیاء کنند، هضم پذیری این پروتئین را افزایش داده و باعث کاهش خاصیت آلرژی زایی آن می شود. استفاده از عوامل شیمیایی احیاکننده مانند دایتیوتریتول (DTT) می تواند هضم پذیری این پروتئین را افزایش دهد. با این حال به دلیل سمی بودن این ماده شیمیایی، استفاده از آنزیم های طبیعی می تواند جایگزین مناسبی باشد. بدین منظور در این مطالعه استفاده از سیستم های تیوردوکسین گیاهی برای افزایش هضم پذیریBLG مورد مطالعه قرار گرفت. تیوردوکسین ها (Trxs)، دی سولفیدردوکتازهای کوچک و فراوانی هستند که در تمام موجودات زنده از پروکاریوت ها تا یوکاریوت های عالی یافت شده اند و در تنظیم ردوکس سلولی دخالت دارند. آنزیم های Trx با توالی آمینواسیدی W (G/P) PC در جایگاه فعال خود شناخته می شوند. این آنزیم ها به کمک سیستئین های موجود در جایگاه فعال و از طریق احیاء برگشت پذیر باندهای دی سولفیدی در فرآیندهای متعدد اکسیداسیون/ احیا شرکت می کنند. آنزیم های Trx خود معمولاً توسط NADPH و به وسیله آنزیم تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH (NTR) مورد احیاء قرار می گیرند. در مطالعات قبلی سه ژن کد کننده OsTrx1، OsTrx20 و OsTrx23 و همچنین ژن کد کننده OsNTR1 در باکتری E.coli به صورت دگرساخت بیان شد. در این مطالعه با در دست داشتن این باکتری های ترانسژنیک مقدار قابل توجهی از این پروتئین ها تولید و خالص سازی شد. با استفاده از آزمون انسولین فعال بودن سه ایزوفرم OsTrx1، OsTrx20 و OsTrx23 تأیید شد. برهمکنش OsNTR1 با هریک از سه ایزوفرم Trx با استفاده از آزمون DTNB مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج این آزمون نشان داد OsNTR1 قادر به احیاء ایزوفرم OsTrx1 وOsTrx23 بود؛ در حالی که OsTrx20 به وسیله OsNTR1 احیاء نشد. بنابراین به منظور احیاء OsTrx20 از گلوتاتیون استفاده شد. البته گلوتاتیون قابلیت احیاءOsTrx1 را هم داشت. بنابراین برای احیاء BLG از سیستم های OsNTR1/OsTrx23، OsNTR1/OsTrx1،GSH/OsTrx1 و GSH/OsTrx20 استفاده شد. بدین منظور BLG ابتدا با اجزای این سیستم ها همراه با NADPH و GSH در دماهای مختلف 4، 25، 37 و 55 درجه سانتیگراد پیش تیمار شد. سپس BLG با تریپسین مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. میزان هضم پذیری BLG با استفاده از ژل SDS-PAGE و RP-HPLC مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد، پیش تیمار BLG با استفاده از سیستم های Trx گیاهی به طور معنی داری (در سطح احتمال ??/?) بر هضم پذیری آن با آنزیم تریپسین مؤثر بود. بین سیستم های مختلف Trx از نظر تأثیر بر BLG تفاوت معتی داری وجود نداشت. تأثیر سیستم های مختلف Trx در دماهای 4، 25 و 37 درجه سانتیگراد مشاهده شد. با این وجود پیش تیمار در دمای 55 درجه سانتیگراد نشان داد که این سیستم ها در دمای ?? درجه سانتیگراد بر هضم پذیری بی تأثیر باشند؛ که این موضوع می تواند به دلیل ناپایداری NTR در این دما باشد. کلمات کلیدی : سیستم NTR/Trx، گلوتاتیون، بتالاکتوگلوبولین، هضم پذیری، تریپسین، کروماتوگرافی مایع فاز معکوس

ارتقاء امنیت وب با وف بومی