SUPERVISOR
Majid Talebi,Badraldinebrahim Seyed tabatabaei
مجید طالبی (استاد راهنما) بدرالدین ابراهیم سیدطباطبایی (استاد راهنما)
STUDENT
Farzaneh Dehghanizadeh baghdad abad
فرزانه دهقانی زاده بغدادآباد
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1394
TITLE
Effects of Kinetin and Gibberellin Treatments on Expression of Flowering Genes in Saffron (Crocus Sativus L.)
Saffron ( Crocus sativus ) from Iridaceae family is known as the most expensive spice in the world. Saffron has six key stages in its life cycle. Among those, the flowering stage of saffron is importance. Many genes control the flowering process in this plant, which the AP1 gene is referred as flowering process markers. Various compounds are produced in the saffron stigma, which carotenoids are the most important and significant combination of saffron straw among them and they are responsible for the color of this spice. The final stage of the production of carotenoids, which includes the glycosylated of the compounds resulting from the loss of Zeaxanthin, is carried out by the Glycosyl transferase 2 enzyme coded by the UGTCs2 gene. There is family MYB transcription factors of upstream of both AP1 and UGT genes. The studies show that the expression of this gene is affected by plant hormones.Therefore, the aim of this study is investigating the effect of different hormones on the expression of MYB gene as well as AP1 and UGT genes. For this purpose, saffron corms were treated with Gibberellic acid (100 and 200 ppm), Salicylic acid (50 and 100 ppm)- Kinetin (10 and 20 ppm), Gibberellic acid (200 ppm)- Kinetin (20 ppm), Salicylic acid (ppm 50) - Kinetin (20 ppm), Gibberellic acid (200 ppm) - Salicylic acid (100 ppm) - Kinetin ??(20 ppm) and Auxin (100 ?g / Corm) - Gibberellic acid (100 ?g / Corm) hormonal treatments. After planting and before sampling, hormonal treatments were again applied as irrigation, and the leaf tissue sampled at 12 and 24 hours after treatments. To do real-time PCR, the specific primers were designed with using oligo7 software and the changes of genes expression were evaluated as hormonal treatments. In this study, there was no adequate amplification using primers design based on MYB gene, despite the studying of different pair primers. The real-time PCR results showed that Kinetin in the concentrations of 10 and 20 ppm in both sampling times, Salicylic acid at 50 and 100 ppm concentrations in both sampling times, Gibberellin in the concentration of 200 ppm in 12 hours after hormonal treatment, the hormone combination of Gibberellin 200 ppm -Salicylic acid 100 ppm -Kinetin 20 ppm in both sampling time and Salicylic acid 50 ppm- Kinetin 10 ppm in both sampling time significantly increased the expression of AP1 gene, but Gibberellin in the concentration of 200 ppm in both sampling times and in the concentration of 100 ppm at 12 hours and the hormonal combination of Auxin 100 ?g / Corm 100 - Gibberellin 100 ?g / Corm 100 g in both sampling times and Gibberellin 20 ppm- Kinetin 200 ppm in both sampling times significantly decreased in AP1 gene expression. In the case of UGT gene, Kinetin hormones in the concentrations of 10 and 20 ppm in both sampling times, Salicylic acid in the concentration of 100 ppm in both sampling times and in 50 ppm concentration at 24 h after hormone treatment, hormonal combinations of Gibberellin 200 ppm -Salicylic acid 100 ppm -Kinetin 20 ppm, and also Gibberellin 200 ppm-Kinetin 20 ppm resulted in the significant increase of expression, and other compounds did not significantly change the expression of this gene. According to the results, Kinetin was considered as the best hormone for inducing of both AP1 and UGT genes expression. Keywords: Saffron, Flowering, Hormone, AP1 , UGT , MYB , Real-time PCR.
زعفران ( Crocus sativus ) متعلق به خانواده Iridaceae و به عنوان گران ترین ادویه در جهان شناخته می شود. زعفران دارای شش مرحله کلیدی در چرخه زندگی خود است. در بین این مراحل، مرحله گلدهی زعفران از اهمیت ویژه ای برخوردار است. ژن های زیادی فرآیند گلدهی در این گیاه را کنترل می کنند که در میان آن ها از ژن AP1 به عنوان نشانگر فرآیند گلدهی نام برده شده است. ترکیبات متنوعی در کلاله زعفران تولید می شود که در این میان کارتنوئید ها مهم ترین و شاخص ترین ترکیبات کلاله زعفران هستند که مسئول ایجاد رنگ در این ادویه می باشند. مرحله نهایی تولید کارتنوئید ها که شامل گلوکزیله شدن ترکیبات حاصل از شکست زئاگزانتین است، توسط آنزیم گلوکوزیل ترانسفراز 2 که توسط ژن UGTCs2 کد می شود، انجام می گیرد. در بالادست هر دو ژن AP1 و UGT خانواده عوامل رونویسی MYB قرار دارد. بررسی ها نشان می دهد که بیان این ژن تحت تاثیر هورمون های گیاهی قرار دارد. لذا هدف از این تحقیق بررسی تاثیر هورمون های مختلف بر میزان بیان ژن MYB و همینطور بیان ژن های AP1 و UGT می باشد. بدین منظور ابتدا کورم های زعفران به وسیله تیمارهای هورمونی جیبرلیک اسید ( ppm100 و 200)، سالیسیلیک اسید (ppm 50 و 100)، کینتین (ppm 10 و 20)، جیبرلیک اسید (ppm 200) - کینتین (ppm 20)، سالیسیلیک اسید (ppm 50) - کینتین (ppm 20)، جیبرلیک اسید (ppm 200) - سالیسیلیک اسید (ppm 100) - کینتین (ppm 20) و همچنین اکسین ( µ g / Corm 100) - جیبرلیک اسید ( µ g / Corm 100) تیمار شد. پس از کشت و قبل از نمونه برداری، مجددا تیمارهای هورمونی به صورت آبیاری اعمال گردید ونمونه برداری از بافت برگ در دو زمان 12 و 24 ساعت پس از هورمون دهی انجام شد. به منظور انجام Real-time PCR آغازگرهای اختصاصی از روی توالی های موجود در بانک اطلاعاتی NCBI به وسیله نرم افزار Oligo7 طراحی شد و تغییرات بیان ژن های مذکور تحت تیمارهای هورمونی طی واکنش Real-time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق علیرغم آزمودن جفت آغازگر های مختلف برای تکثیر و متعاقبا اندازه گیری بیان ژن MYB، تکثیر مناسبی حاصل نگردید و اندازه گیری بیان این ژن میسر نشد. نتایج داده های حاصل از Real-time PCR دو ژن AP1 و UGT نشان داد که کینتین در غلظت های ppm 10 و20 در هر دو زمان نمونه برداری، سالیسیلیک اسید در غلظت ppm 50 و 100 در هر دو زمان نمونه برداری، جیبرلین در غلظت ppm 200 در 12 ساعت پس از هورمون دهی، ترکیب هورمونی جیبرلین ppm 200- سالیسیلیک اسید ppm 100-کینتین ppm 20 در هر دو زمان نمونه برداری و ترکیب سالیسیلیک اسید ppm 50-کینتین ppm 10 نیز در هردو زمان نمونه برداری به طور معناداری بیان ژن AP1 را افزایش دادند اما هورمون جیبرلین در غلظت ppm 200 در هر دو زمان نمونه برداری و در غلظت ppm 100 در زمان 12 ساعت و ترکیب های هورمونی اکسین µ g / Corm 100 – جیبرلین µ g / Corm 100 در هر دو زمان نمونه برداری و جیبرلین ppm 200- کینتین ppm 20 در هر دو زمان نمونه برداری به طور معناداری کاهش بیان ژن AP1 را به همراه داشتند. در مورد ژن UGT نیز هورمون های کینتین در غلظت های ppm 10 و 20 در هردو زمان نمونه برداری، سالیسیلیک اسید با غلظت ppm 100 در هردو زمان نمونه برداری و با غلظت ppm 50 در زمان 24 ساعت پس از هورمون دهی، ترکیب های هورمونی جیبرلین ppm 200- سالیسیلیک اسید ppm 100-کینتین ppm 20 و همینطور جیبرلین ppm 200- کینتین ppm 20 منجر به افزایش بیان معنی دار آن شدند وسایر ترکیبات تغییر معناداری در بیان ژن مذکور ایجاد نکردند. با توجه به این نتایج، هورمون کینتین بهترین هورمون در القای بیان هر دو ژن AP1 و UGT در نظر گرفته شد. کلمات کلیدی: زعفران، گلدهی، هورمون، AP1 ، UGT ، MYB ، Real-time PCR