Skip to main content
SUPERVISOR
Azar Shahpiri,Hasan Karemmojeni
آذر شاه پیری (استاد راهنما) حسن کریم مجنی (استاد مشاور)
 
STUDENT
Negar Azizi
نگار عزیزی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1396

TITLE

Cloning and heterologous expression of gene encoding phytochelatin synthase from sunflower (Helianthis annus) in Escherichia coli and study of arsenic accumulation in the engineered bacterium
Arsenic is a very poisonous element for human health. Unfortunately, due to proximity with industrial centers, some cities are highly poisoned with arsenic. Nowadays production of engineering bacteria which can absorb arsenic effectively has caught scientist’s attention. In general, phytochelatins are known as one group of protein chelators in plants with high binding affinity to heavy metals. Phytoclatins are a family of cysteine-rich peptides and their general formula is (y-Glu-Cys) n -Gly that “n” can be from 2 to 11. Phytochelatins are produced in a metabolic pathway from the precursor glutathione by an enzyme called phytochelatin synthase (PCS). The activity of the enzyme phytoclatin synthase is strongly regulated by metal ions such as cadmium, arsenic, lead and mercury. In the present work, RNA was extracted from the leaves of Helianthius annuus and cDNA was prepared by reverse transcription. Using the specific primers which was designed based on the PCS sequence the gene encoding PCS was amplified and cloned in the expression vectors pET28a and pET41a. The new constructs were transformed to strains Rosetta (DE3). The protein His-PCS was expressed in R-28-PCS after induction with IPTG in the strain R-pET-PCS. However the dominant amount of protein was remained in the form of inclusion bodies. The transfer of protein from insoluble form to soluble fraction was enhanced when the protein was heterologously expressed as GST-PCS using pET41a as vector. However, still the high amount of protein was in the unsalable fraction. To cope with this problem the construct pET41a-PCS was transferred to Rosetta gami2. In this strain the solubility of GST-PCS was enhanced to 70%. In order to study the synthesis of phytochelatin, the HPLC analysis using PC3 as a commercial standard was performd. Phytochelatin production was confirmed in presence of AS 3+ , As 5+ and Cd 2+ ions by HPLC. Nevertheless, when Rg-41-PCS was grown in medium lacking metals, no phytochelatin production was observed. This finding shows that phytochelatin synthase is active only in presence of metals, and its activity leads to phytochelatin production. Rg-41-PCS strain growth curve in medium containing As 5+ ion and its comparison with control strain growth curve in similar medium shows resistance of this strain to As 5+ ion. Also, this strain was able to absorb 10.67 µlmol/gDCW As 5+ in the medium containing 0.5 mM As 5+ . Although according to growth curve of Rg-41-PCS strain, no resistance to As 3+ and Cd 2+ was observed, but this strain was able to absorb 7.58 µmol/gDCW As 3+ and 25.97 µmol/gDCW in medium containing 0.5 mm As 3+ and Cd 2+ . The accumulated amounts of ions in these engineered strains have been high. Therefore, PCS gene can be introduced as a suitable gene for genetic engineering of soil bacteria. Key terms: Sunflower, Phytochelatin synthase, Phytochelatin, Arsenic, Cadmium, Recombinant protein, Transgenic strains, Accumulation of metal
آرسنیک یک عنصر بسیار سمی برای سلامتی انسان است. متأسفانه، به دلیل همجواری با مراکز صنعتی ، برخی از شهرها به شدت با آرسنیک سمی شده‌اند. امروزه تولید باکتری‌های مهندسی شده که می‌توانند آرسنیک را در خود تجمع نمایند ، توجه دانشمندان را به خود جلب کرده است. بنابراین، شناسایی کلاته کننده‌های پروتئینی یا غیر پروتئینی در موجودات از اهمیت زیادی برخوردار است. به طور کلی، متالوتیونین‌ها و فیتوکلاتین‌ها به عنوان دو گروه پروتئین کلاته کننده در گیاهان با میل اتصال زیاد به فلزات سنگین شناخته می شوند. به نظر می‌رسد که برای اتصال به آرسنیک فیتوکلاتین کارآمدتر از متالوتیونین‌ها هستند. فیتوکلاتین‌ها خانواده‌ای از پپتید‌های غنی از سیستئین با فرمول کلی (y-Glu-Cys) n -Gly (n=2-11) هستند که در یک مسیر متابولیکی از گلوتاتیون به عنوان پیش ماده توسط آنزیمی به نام فیتوکلاتین سنتاز سنتز می‌شوند و در تجمع، سم زدایی و متابولیسم یون‌های فلزات سنگین در سلول‌های گیاهی نقش دارند. فعالیت آنزیم فیتوکلاتین سنتاز به شدت توسط یون‌های فلزی مانند کادمیوم، آرسنیک، سرب و جیوه تنظیم می‌شود. در این تحقیق به منظور همسانه سازی ژن کد کننده فیتوکلاتین سنتاز از گیاه Helianthius annuus استخراج RNA و تهیه cDNA با رونویسی معکوس انجام شد. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی که بر اساس توالی فیتوکلاتین سنتاز طراحی شد، ژن رمزگذار فیتوکلاتین سنتاز تکثیر و در وکتورهای بیانی pET28a و pET41a همسانه سازی شد. سازه‌های جدید به سویه‌های Rosetta (DE3) منتقل شدند. پروتئین His-PCS پس از القا با IPTG در سویه R-28-PCS بیان شد. با این حال مقدار غالب پروتئین به شکل اجسام اینکلوژن بادی باقی مانده بود. استفاده از شریک الحاقی GST با استفاده از وکتور PET41a در سویه R-41a-PCS انتقال پروتئین از فرم نامحلول به محلول را افزایش داد. با این حال، هنوز هم مقدار زیاد پروتئین در فرم نامحلول باقی ماند. برای کنار آمدن با این مشکل سازه pET41a-PCS به Rosetta gami2 منتقل شد. در این سویه حلالیت GST-PCS به 70? افزایش یافت. به منظور مطالعه سنتز فیتوکلاتین، HPLC با استفاده از PC3 به عنوان یک استاندارد تجاری انجام شد. تولید فیتوکلاتین در حضور یون‌های AS 3+ ، + AS 5 وCd 2+ توسط HPLC تأیید شد. با این وجود، هنگامی که Rg-41-PCS در محیطی فاقد فلز رشد کرد، تولید فیتوکلاتین مشاهده نشد. این یافته نشان می‌دهد که فیتوکلاتین سنتاز فقط در حضور فلزات فعال است و فعالیت آن منجر به تولید فیتوکلاتین می‌شود. منحنی رشد Rg-41-PCS در محیط حاوی یون As 5+ و مقایسه آن با منحنی رشد شاهد در محیط مشابه مقاومت این سویه را در برابر یون As 5+ نشان می‌دهد. همچنین، این سویه توانست µmol/gDCW 67/10 As 5+ را در محیط حاوی 5/0 میلی مولار As 5+ جذب کند. اگرچه با توجه به منحنی رشد سویه Rg-41-PCS ، هیچ مقاومتی در برابر As 3+ و Cd 2+ مشاهده نشد، اما این سویه قادر به جذب µmol/gDCW 58/7 As 3+ و µmol/gDCW 97/25 Cd 2+ در محیط حاوی 5/0 میلی مولار As 3+ و Cd 2+ بود. مقادیر انباشت یون در این سویه‌های مهندسی شده بسیار بالا است. بنابراین می‌توان ژن فیتوکلاتین سنتاز را به عنوان ژن مناسبی برای مهندسی ژنتیک باکتری‌های خاک معرفی کرد. کلمات کلیدی: آفتابگردان، فیتوکلاتین سنتاز، فیتوکلاتین، آرسنیک، کادمیوم، پروتئین نوترکیب، سویه‌های تراریخته، تجمع فلز

ارتقاء امنیت وب با وف بومی