بررسی تنوع ژنتیکی و تحمل به شوری در برخی ژنوتیپ های ایرانی Bromus danthoniae

STUDENT

DEGREE

YEAR

In this study, 82 Bromus danthoniae genotypes originated from West (non-saline) and Northwest (saline) Iran were investigated in four experiments. Genetic variation of 82 genotypes was evaluated using morphological traits. Cytogenetic variation of 14 genotypes was assessed in the second experiment. According to our results the mitotic chromosome size of this species was medium to large and all of the karyotypes possessed one two two pairof satellited chromosomes. In the third experiment, salinity tolerance of 80 genotypes was evaluated under control and 350 mM NaCl conditions using physiological traits. Results showed a significant genotypic (G) variation for all traits as well as significant salinity stress (S) and G × S effects for most of the traits. In addition, a coincidence of low concentrations of Na + in the leaf tissues and the excretion of salt crystals on the sheath leaves/leaf blades was observed in the hyper-salinity tolerant genotypes. Eight important salinity tolerance genes, NHX1, NHX3, SOS1, HKT1;5, AKT1, SAT32, SnRK2.3 and DREB2 were characterized by sequencing in the fourth experiment. The results indicated that the partial sequences of coding regions of these genes were same in both salt tolerant and salt sensitive genotypes. The phylogenic trees for the studied genes showed that B. danthoniae was included in a common group with other grass species and possessed the highest similarities with Triticum ., Aegilopes . and Hordeum vulgare . Key words : Salt stress, Bromus danthoniae , salt excretion, salt tolerant genes

گونه Bromus danthoniae Trin. یک گراس یکساله، خودگشن و مرتعی است که به خوبی در اقلیم های سخت بیابانی رشد کرده و از منابع ژنتیکی مهم تحمل به تنش های محیطی به ویژه شوری محسوب می شود. با این وجود تا کنون مطالعه جامعی بر روی این گونه چه از نظر ارزیابی های غربال گری و یا مکانیسم های تحمل به تنش های محیطی در این گیاه صورت نگرفته است. بنابراین مطالعه حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی و تحمل شوری در این گونه در قالب 4 آزمایش برنامه ریزی و اجرا شد. آزمایش اول: بررسی تنوع مورفولوژیک، آزمایش دوم: بررسی تنوع سیتوژنتیک، آزمایش سوم: ارزیابی تحمل شوری در دو مرحله جوانه زنی و رشد رویشی و آزمایش چهارم: ردیابی ژن های درگیر در تحمل شوری. مواد ژنتیکی مورد استفاده در این پژوهش 82 ژنوتیپ B. danthoniae جمع آوری شده از مناطق غرب و شمال غرب کشور شامل استان های آذربایجان غربی (سواحل قدیم و جدید دریاچه ارومیه)، کردستان، کرمانشاه و ایلام بود. بررسی تنوع مورفولوژیک با استفاده از بذور همه 82 ژنوتیپ و با اندازه گیری 20 صفت کیفی و 27 صفت کمی مورفولوژیک نشان دهنده تنوع بسیار بالای بین ژنوتیپ ها بود. نتایج تجزیه کلاستر نشان داد که گروه بندی ژنوتیپ ها بیشتر با خصوصیات واریته های موجود در این جمعیت همخوانی داشت نه موقعیت جغرافیایی نمونه ها. انجام آزمایش سیتوژنتیک با استفاده از 14 ژنوتیپ نشان داد از نظر کاریوتیپی، نمونه های مورد مطالعه دارای 2 سطح پلوئیدی (دیپلوئید و تتراپلوئید) بودند. ویژگی بارز کروموزوم ها، اندازه بزرگ و ماهواره های مشخص در کاریوتیپ بود. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ ها برای همه صفات مورد مطالعه اختلاف معنی دار وجود داشت. علاوه بر این ژنوتیپ های منشأ گرفته از سواحل دریاچه ارومیه به طور کلی تحمل بیشتری نسبت به تنش شوری در مرحله جوانه زنی در مقایسه با ژنوتیپ های جمع آوری شده از سایر مناطق نشان دادند. ارزیابی فیزیولوژیک تحمل به شوری در مرحله رشد رویشی با 80 ژنوتیپ در شرایط گلخانه و اعمال شوری با دو سطح 0 و 350 میلی مولار کلریدسدیم انجام شد. نتایج نشان داد ژنوتیپ های مورد مطالعه از نظر همه صفات دارای اختلاف معنی دار در دو سطح تنش و شاهد بودند. همچنین تنش شوری صفات وزن تر، وزن خشک، محتوای نسبی آب (RWC)، محتوای سدیم، پتاسیم،نسبت پتاسیم به سدیم، نسبت کلسیم به سدیم، نشت الکترولیت های غشاء و میزان مالون دی آلدئید (MDA) را به طور معنی داری تحت تأثیر قرار داد، در حالیکه صفات ارتفاع، آب از دست رفته از برگ جدا شده(ELWL)، میزان کلسیم و محتوای پراکسید هیدروژن (H 2 O 2 ) تحت تأثیر شوری قرار نگرفتند. از طرفی اثرمتقابل ژنوتیپ× تنش نیز برای صفات در صد زنده ماندن، محتوای سدیم، پتاسیم، کلسیم، نسبت های پتاسیم به سدیم و کلسیم به سدیم، نشت الکترولیت های غشاء، میزان MDA و H 2 O 2 نیز معنی دار بود. به طور کلی نتایج نشان دهنده وجود تنوع ژنتیکی بالا بین ژنوتیپ های مورد مطالعه از نظر تحمل به شوری بود. همچنین گروه متحمل ترین ژنوتیپ ها صرفاً به ژنوتیپ های جمع آوری شده از مناطق شور اختصاص داشت، و در گروه حساس ترین ژنوتیپ ها به تنش شوری، ژنوتیپ های با منشأ نواحی نرمال (غیرشور) قرار داشتند. به منظور ردیابی ژن های تحمل شوری، بر اساس نتایج حاصل از آزمایش فیزیولوژی و پس از غربال سازی ژنوتیپ ها، 2 ژنوتیپ USLN6 و KUR10 به ترتیب به عنوان ژنوتیپ های متحمل و حساس انتخاب شده و ردیابی و توالی یابی 8 ژن شناخته شده تحمل به شوری در این ژنوتیپ ها انجام شد. هشت ژن انتخابی در این مرحله شامل 5 ژن کلیدی و اختصاصی تحمل به تنش شوری بودند ( NHX1 ، NHX3 ، SOS1 ، HKT1;5 و AKT1 )، بعلاوه 2 ژن که در انتقال علامت به ویژه در مسیر ABA نقش دارد ( SnRK2.3 و SAT32 ) و1 ژن کد کننده عامل رونویسی ( DREB2 ) بود. جهت طراحی آغازگر ابتدا توالی ژن های مورد نظر در گیاهان خویشاوند گونه Bromus danthoniae که قبلاً شناسایی شده بودند جست و جو شد و با استفاده از نواحی حفاظت شده این ژن hy;ها و بر اساس اصول طراحی آغازگر، جفت آغارگرهای اختصاصی مربوط به هر ژن طراحی و ساخته شد. نتایج توالی یابی قطعات تکثیر شده نشان داد ژنوتیپ های مورد بررسی اگرچه در توالی DNA اختلاف جزئی داشتند ولی در توالی اسیدآمینه مربوطه کاملاً شبیه به هم بودند. بنابراین آنچه سطوح متفاوت تحمل به شوری را در این گونه ایجاد می کند، تفاوت در توالی اسیدنوکلئیک نبوده بلکه تفاوت در بیان این ژن ها در سطوح مختلف تنظیم بیان ژن موجب این اختلاف شده است. از طرف دیگر بررسی درخت فیلوژنی مربوط به هر ژن به خوبی بیانگر رابطه تکاملی بین گونه ها بود. همچنین گونه B. danthoniae در فاصله بسیار نزدیکی با گونه های گندم، اجیلوپس و جو قرار گرفت. بنابراین هماهنگی دندروگرام های بدست آمده با رابطه گونه ها حتی در سطوح بسیار پایین طبقه بندی حاکی از اینست که تغییر در توالی های DNA کاملاً با روند تکاملی گونه ها همسو بوده است. کلید واژه ها : تنش شوری، ترشح نمک، ژن های تحمل به شوری، Bromus danthoniae