SUPERVISOR
سعید انصاری مهیاری (استاد مشاور) سیدحمید زرکش اصفهانی (استاد مشاور) حمیدرضا رحمانی (استاد راهنما) محمد خوروش (استاد راهنما)
STUDENT
Bahare Etesam
بهاره اعتصام
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1388
TITLE
Immunohistochemical Study on the IGF-I and Insulin Receptors Density in Granulosa and Theca Cells of Dairy Cows
Reproductive traits are some of the most determinative parameters in dairy cow breeding industry; and due to low level of inheritance of these attributes, reproduction mechanisms are of the prime consideration, and therefore, knowing the affective hormones will be in high level of priority. Reproduction system activity needs the collaboration of primary and secondary reproductive hormones. Growth factors and metabolic hormones like Insulin and IGF-I have considerable influences on ovarian regulation. Insulin and IGF-I act as important mediators of follicular development, steroidogenesis, oocyte maturity and finally fetus growth. In addition to the glucose transition to inner side of cells, Insulin hormone has an mitogenic role that is very significant in the life and fertility of ovules. IGF-I affects the increase of follicle sensitivity to the Gonadotropins and causes the follicle development and ovulation. Regardless to the Insulin and IGF-I concentration in blood, the gene expression of IGF-I and Insulin receptors and their densities in granulosa are effective on the follicular growth and activity and steroids production. The expression of mRNA in insulin and IGF-I receptors, have changed remarkably, in granulosa cells and theca cells, through pre-antral stage to pre-ovulatory (antral) stage. As the same way, the expression of IGF receptors increases in granulosa cells and theca cells during the final levels of follicular improvement and decreases with the start of atresia. Tracking and estimating the density of Insulin and IGF-I receptors via methods like immunohistochemical technique, could be helpful to improve the understanding of the role of these hormones in reproduction. In this study, 30 ovaries of dairy cattle were collected post mortem from several local slaughterhouses in Isfahan area that contained 20 ovaries from non-fertile cattle and 10 ovaries from fertile ones with the age range of 2-7 years. The ovaries had been fixed with formalin 10%, then for immunohistochemical and H E staining via Envision method, appropriate paraffin blocks were chosen from samples. We used one of the abcam ® co. products with identification code: ab39675 that was an anti-rabbit monoclonal antibody and firstly had cross reaction with IGF-I receptor and also with Insulin receptor and its related proteins. Based on the intensity and expanse of staining method, the results were expounded in the Allred 8-units scored system. The results revealed considerable statistical differences both in intensity and expanse of staining in density of receptors in ovary tissues of fertile and non-fertile dairy cows (p 0.0001). Staining expanse was notably higher in theca cells than granulosa cells. The staining intensity in stroma cells was more weak than the theca and granulose cells. The staining intensity developed from pre-antral follicles to antral follicles. Receptors presence in corpus luteum and blood veins was confirmed. The amount of staining in corpus albicans was nothing. Finally, we can conclude that the presence of the receptors of Insulin and IGF-I hormones in ovarian cells demonstrates the effect of metabolic conditions of cattles on ovary activities; so the density of these hormone receptors in ovarian tissue and around oocyt could be consider as one of fertile or non-fertile indices. Keywords : Dairy cattle, Insulin, IGF-I, Insulin and IGF-I receptors, Immunohistochemistry
صفات تولید مثــلی یکـی از مهمتـریـن پارامتــرهای تعیین کننده در صنعت پرورش گاو شیری می باشند. لذا توجه به مکانیسم های تولید مثلی و شناخت هورمون های تأثیرگذار امری مهم محسوب می شوند. فعالیت دستگاه تولید مثل نیازمند همکاری هورمون های اولیه و ثانویه تولید مثلی می باشد. عوامل رشد و هورمون های متابولیکی مثل انسولین و IGF-I در تنظیم تخمدان تأثیر بسزایی دارند. انسولین و IGF-I به عنوان میانجیگرهای مهم توسعه فولیکولی، استروئیدوژنز، بلوغ اووسیت و نهایتاً رشد و توسعه جنین عمل می کنند. هورمون انسولین علاوه بر بحث انتقال گلوکز به داخل سلول دارای نقش میتوژنیک می باشدکه در حیات و باروری تخمک بسیار مهم و حیاتی است. IGF-I در افزایش حساسیت فولیکول ها به گنادوتروپین ها نقش داشته و باعث رشد فولیکول و به دنبال آن تخمک گذاری می شود. جدا از غلظت انسولین و IGF خون، بیـان ژن گیرنده های IGF وانسولین و تراکم آنها در سلولهای گرانولوزا در رشد و عملکرد فولیکول ها و تولید استروئیدها مؤثر است. در سلول های گرانولوزا و تکا بیان mRNA گیرنده انسولین در طی مرحله پری آنترال به مرحله قبل از تخمک اندازی به طور قابل ملاحظه ای تغییر می کند. بیان گیرنده IGF نیز به طور مشابه در سلولهای تکا وگرانولوزا در طی مراحل پایانی تکامل فولیکول افزایش یافته و با شروع آترزیا کاهش می یابد. بنا بر آنچه گفته شد مشاهده و تخمین تعداد گیرنده های IGF و انسولین توسط روش هایی مانند ایمونوهیستوشیمی می تواند به درک بهتر از نقش این دو هورمون در تولید مثل کمک کند. در آزمایش حاضر، 30 عدد تخمدان گاو شیری از کشتارگاه های محلی در سطح استان اصفهان جمع آوری شده که 20 عدد از آنها مربوط به گاوهای نابارور و 10 عدد دیگـر متعلق به گاوهـای بارور در محدوده سنی 2 الی 7 سال بودند. تخمــدان ها در فرمـالین 10% فیکس شده و سپس به منظور انجام رنگ آمیــزی H E و ایمـونوهیستوشیـمی به روش Envision ، از هر نمونه بلوک های پارافینی مناسب تهیه گردید. رنگ آمیزی با استفاده از آنتی بادی منوکلونال خرگوش برای گیرنده IGF-I و سوبسترای کروموژن انجام شد. آنتـی بـادی به کار رفته یک آنتی خرگوش منوکلونال محصول شرکت abcam ® با کد شناسایی ab39675 بوده که در درجه اول با گیرنده IGF-I و نیز با گیرنده انسولین و پروتئین های مرتبط با گیرنده انسولین واکنش متقابل دارد. نتایج مطابق سیستم اسکوربندی هشت واحدی Allred و براساس شدت و وسعت رنگ آمیزی تفسیر شدند. این نتایج نشان دهنده اختلاف معنی دار آماری هم به لحاظ شدت رنگ پذیری و هم از نظر وسعت رنگ پذیری بین میزان گیرنده ها در بافت تخمدان گاوهای بارور و نابارور بودند (0001/0 p ). وسعت رنگ آمیزی در سلول های تکا به مراتب بیشتر از سلول های گرانولوزا بود. شدت رنگ آمیزی در سلول های استـروما خیلی ضعیف تر از سلول های تکـا و گرانـولوزا بود. شدت رنگ آمیـزی از فولیکول های پری آنترال تا آنترال تشدید شد. حضور گیرنده ها در سلول های جسم زرد و رگ ها تأیید شد. میزان رنگ پذیری جسم سفید در حد صفر بود. در پایان می توان نتیجه گرفت حضور گیرنده هورمون های انسولین و IGF-I در سلول های تخمدان بیانگر تأثیر شرایط متابولیکی دام بر عملکرد تخمدان است؛ بنابراین میزان گیـرنده های موجود از این هورمون ها در بافت تخمـدان و اطراف اووسیت یکی از شـاخص های باروری و ناباروری به شمار می آید. کلید واژه: گاو شیری، انسولین، IGF-I ، گیرنده انسولین و IGF-I ، ایمونوهیستوشیمی