Skip to main content
SUPERVISOR
Javad Keramat,Nasser Hamdami,Omidvar Farhadian
جواد کرامت (استاد راهنما) ناصر همدمی (استاد مشاور) امیدوار فرهادیان (استاد مشاور)
 
STUDENT
Majideh Jamshidi
مجیده جمشیدی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1392

TITLE

Optimization of enzymic extraction of protein and biopeptide and investigation high voltage electrode discharge method for protein and biopeptide extraction from Gelidiella acerosa (Oman sea macroalgae)
The total global demand for protein from both humans and livestock will rose substantially into the future due to combined increase in population and per capita consumption of animal protein. Currently, net protein is primarily produced by agricultural crops. However, the future production of agricultural crops is limited by a finite supply of arable land, fresh water and synthetic fertilizers. Alternative protein sources and production methods are required to fulfil the demand of consumers and to meet predicted global protein requirements. Seaweeds as alternative crops have the potential to help meet the protein demand without applying the additional stress on traditional agricultural resources. This thesis investigates the potential of seaweed as an alternative crop for production of protein. This research was conducted in four different studies. In the first study, application of response surface methodology (RSM) for enzymic treatment optimization of Gelidiella acerosa was investigated in order to improve the extraction of algal proteins using Viscozyme and Celluclast. The total protein, soluble proteins and reducing sugar recovery in the water-soluble fraction were studied in relation to the hydrolysis time, type and concentration of the enzymes. Enzymatic digestion appeared to be an effective treatment for protein extraction. While enzyme hydrolysis by Celluclast was able to facilitate the protein extraction, it was a relatively inefficient way to improve protein extraction yield, in comparison with Viscozyme. The optimum conditions for protein extraction were found to be hydrolysis by 2.8 µl ml -1 of Viscozyme L for 12h. Eencouraged by non-thermal, chemical-free and energy efficiency properties of HVED processes, we set out to test the working hypothesis that HVED will enable protein extraction from G. acerosa in the second study. We found that application of 900 electric discharge with electrodes distance of 10 mm in a liquid-to-solid ratio of 60, pulse repetition rate of 0.5 Hz and combined with enzyme hydrolysis of the treated samples for 4 g by 2 µl ml -1 of Viscozyme led to selective extraction of water soluble proteins. There was no significant difference in protein concentration between enzymic hydrolysis and this method of extraction (p 0.05). In the third study, RSM was used to determine the optimal conditions for enzymic extraction of peptides by Alcalase from proteins extracted in optimal conditions of enzymic hydrolysis (E) and HVED-assisted enzyme hydrolysis (H). The highest DH was obtained when hydrolysis time and ratio of enzyme to substrate were 3 h and 4% in optimum temperature and pH (55 o C, 8.0), respectively. UF was used to fractionation of peptides on the base of molecular weight (MW: 1, 3, 5, 10 and 30 kDa). Additionally, antioxidative, ACE inhibitory activity, and antibacterial properties of peptide fractions were described. We used the DPPH assay to evaluate the capacity of E and H peptides to quench radical species. All H peptides exhibited higher scavenging effect than that of E. The higher radical scavenging capacity from hydrolysates could be due to the low MW peptides. Hydrolysates showed good antihypertensive activity (higher than 60% of ACE inhibition). The ACE inhibitory activities of the hydrolysates varied with the molecular weight distribution, and the peptides with MW below 5 kDa showed the most potent ACE inhibitory activity. Antibacterial activity was evaluated against Gram negative and Gram-positive bacteria and none of peptides have activity against bacteria. In forth study, hydrolysates were analysed using RP-HPLC-ESI-Quadrupole-Time-of-Flight (Q-TOF) system. Finally, analysis of data was performed by the de novo sequencing tool. Analysis of hydrolysate enabled the identification of 23 peptides in H peptides and 17 in E peptides with typical features of antioxidant and antihypertensive peptides. Identified peptides in fractions showed less than 10 amino acids and a high number of hydrophobic and aromatic amino acids, which are characteristic features for antioxidant and antihypertensive peptides. Key Words Gelidiella acerosa, protein extraction, enzyme hydrolysis, HVED, biopeptide, antioxidant activity, ACE inhabitation, RP-HPLC-ESI- Q-TOF, de novo sequencing.
با افزایش همزمان جمعیت جهان و سرانه مصرف پروتئین حیوانی، تقاضای جهانی برای پروتئین مصرفی انسان و دام به طور چشمگیری افزایش خواهد یافت. در حال حاضر، پروتئین خالص در درجه اول توسط محصولات کشاورزی تولید می شود، اما تولید محصولات کشاورزی در آینده بدلیل عرضه محدود زمین های زراعی، آب شیرین و کودهای مصنوعی با محدودیت مواجه است. منابع پروتئین جایگزین و روش های تولیدی برای تامین تقاضای مصرف کنندگان و برآوردن نیازهای پروتئین جهانی پیش بینی شده، لازم است. جلبک های دریایی به عنوان محصولات جایگزین دارای پتانسیل لازم برای پاسخگویی به تقاضای پروتئین، بدون اعمال فشار اضافی بر منابع کشاورزی سنتی هستند. در این تحقیق، پتانسیل جلبک دریایی به عنوان یک محصول جایگزین برای تولید پروتئین، مورد بررسی قرار گرفته است. این پژوهش در قالب چهار مطالعه مختلف انجام شد. در مطالعه اول، استفاده از روش سطح پاسخ (RSM) به منظور بهینه سازی تیمار آنزیمی جلبک Gelidiella acerosa برای بهبود استخراج پروتئین های جلبک با استفاده از آنزیم های ویسکوزیم و سلوکلاست مورد بررسی قرار گرفت. مقدار پروتئین کل، پروتئین های محلول و قند احیا استخراج شده در رابطه با زمان هیدرولیز، نوع و غلظت آنزیم مورد مطالعه قرارگرفت. هیدرولیز آنزیمی روشی مؤثر برای استخراج پروتئین جلبک بود. در حالیکه هیدرولیز آنزیمی توسط آنزیم سلوکلاست قادر به استخراج پروتئین جلبک بود راندمان استخراج پروتئین با ویسکوزیم بالاتر بود. شرایط بهینه استخراج پروتئین توسط هیدرولیز آنزیمی با ویسکوزیم به غلظت 8/2 میکرولیتر در میلی لیتر به مدت 12 ساعت بدست آمد. ویژگی هایی نظیر غیر حرارتی بودن، عدم نیاز به مواد شیمایی و بهره وری انرژی در روش تخلیه الکتریکی با ولتاژ بالا (HVED) ما را بر آن داشت که امکان استخراج پروتئین توسط HVED را در مطالعه دوم این تحقیق مورد بررسی قرار دهیم. استفاده از 900 تخلیه الکتریکی در سیستم HVED با اعمال فاصله الکترودی 10 میلی متر، نسبت مایع به جامد 60 و نرخ تکرار پالس 5/0 هرتز در تلفیق با هیدرولیز آنزیمی زیست توده جلبک تیمار شده، با آنزیم ویسکوزیم به غلظت 2 میکرولیتر در هر میلی لیتر به مدت 4 ساعت، منجر به استخراج انتخابی پروتئین های محلول در آب شد. تفاوت معنی داری بین مقدار پروتئین استخراج شده با این روش تلفیقی در مقایسه با هیدرولیز آنزیمی مشاهده نشد (p 0.05). در مطالعه سوم، از RSM به منظور تعیین شرایط مناسب برای استخراج آنزیمی پپتیدها توسط آنزیم آلکالاز از پروتئین های استخراج شده در شرایط بهینه هیدرولیز آنزیمی (E) و روش تلفیقی (H) مورد استفاده قرار گرفت. بیشترین مقدار درجه هیدرولیز در شرایطی که زمان هیدرولیز و نسبت آنزیم به سوبسترا به ترتیب معادل 3 ساعت و 4 درصد بود در شرایط دما و pH بهینه آنزیم( o C 55 و 8) بود، بدست آمد. برای تفکیک پپتیدها بر اساس وزن مولکولی از سیستم فراپالایش استفاده شد. همچنین خواص آنتی اکسیدانی، مهار آنزیم ACE و ضدباکتریایی پپتیدهای تفکیک شده بررسی شد. برای ارزیابی ظرفیت پپتیدهای گروه E و H در مهار گونه های رادیکالی از روش DPPH استفاده کردیم. تمام پپتیدهای گروه H اثرات مهارکنندگی بیشتری نسبت به گروه E داشتند. این ظرفیت مهارکنندگی بیشتر در هیدرولیزات ها می تواند به علت کمتر بودن وزن مولکولی پپتیدها باشد. هیدرولیزات ها فعالیت ضد فشار خون بالای خوبی از خود نشان دادند (با بیش از 60 درصد قدرت مهار ACE). فعالیت مهار ACE هیدرولیزات ها با توزیع وزن مولکولی متفاوت بود و پپتیدهای با وزن مولکولی کمتر از 5 کیلو دالتون، فعال ترین مهار کننده های ACE بودند. فعالیت ضد باکتریایی در برابر باکتری های گرم منفی و گرم مثبت مورد بررسی قرارگرفت و هیچ یک از پپتیدها در برابر باکتری ها فعالیت نداشت. در مطالعه چهارم، هیدرولیزات ها توسط سیستم ESI-Q-TOF RP-HPLC آنالیز شدند و آنالیز داده های مربوط به توالی پپتیدی توسط سیستم توالی یابیDe novo انجام شد. تجزیه و تحلیل هیدرولیزات ها امکان شناسایی 23 پپتید در گروه پپتیدی H و 17 در گروه پپتیدی E با ویژگی های معمول پپتید های آنتی اکسیدان و ضد فشار خون را فراهم کرد. پپتیدهای شناسایی شده حاوی کمتر از 10 اسید آمینه و تعداد زیادی اسیدهای آمینه آبگریز و آروماتیک بودند که از ویژگی های شاخص پپتیدهای آنتی اکسیدان و ضد فشار خون است. کلمات کلیدی: Gelidiella acerosa ، استخراج پروتئین، هیدرولیز آنزیمی، تخلیه الکتریکی ولتاژ بالا (HVED)، پپتید زیست فعال، فعالیت آنتی اکسیدانی، مهار ACE، RP-HPLC-ESI-Q-TOF ، توالی یابی De novo

ارتقاء امنیت وب با وف بومی