SUPERVISOR
مهدی کدیور (استاد راهنما) آریو امامی فر (استاد مشاور) میلاد فتحی (استاد راهنما) مهرداد نیاکوثری (استاد مشاور)
STUDENT
Elaheh Shanesazzadeh
الهه شانه ساززاده
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1391
TITLE
Production of nanofibers based on sunflower protein isolate for vitamin D encapsulation
Sunflower protein is among the most valuable proteins, constituting the main part of the sunflower meal. Forming complex between these proteins and dark phenolic compounds, make their use in food stuffs hard and they are usually discarded, so that, till now no commercial applications were suggested for them. In the present study, sunflower protein isolate (SPI) was extracted from the meal by the means of isoelectric sedimentation method. Protein nanofibers were fabricated by adding polyvinyl alcohol (PVA) (8%) to sunflower protein solution (16.6%).Then, the effects of two fundamental parameters, voltage (18 and 23 KV) and feed rate (0.5 and 0.75 mL/h) and also different ratios of SPI/PVA (100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 and 0:100) on the fibers’ morphology and diameter were investigated. It was observed that uniform fibers with no beads or breakages were obtained by using SPI/PVA solution at ratio 60:40, voltage 18 KV and feed rate 0.75 mL/h which produce nanofibers with the average diameter of 398 nm. In order to apply fibers in food matrix (usually aqueous media), it’s necessary to make them hydrophobic. For this purpose, the effects of physical treatment by heating (150°C, 24h), chemical treatment by CaCl 2 (1%, 30 min soaking) and their combination were investigated. It was observed that only heating made nanofibers hydrophobic, since SEM images showed that after 24 h soaking in lactate buffer, fibers’ structure was maintained with no significant changes in diameter. Measuring the angle of water drop on nanofibers’ surface showed heating increased contact angle from 40° to 110°, which confirm hydrophobic nature of heated nanofibers. By comparison of FTIR and DSC/TGA analysis of fibers before and after heating, it was suggested that heat treatment caused ester bond formation between –COOH groups of protein and –OH groups of PVA which this reaction, beside egression of water molecules, make fibers hydrophobic. In order to vitamin D (VD) encapsulation, coaxial electrospinning method was applied using zein (20% solution) as a hydrophobic and spinnable polymer in the sheath and mixture of SPI (4%, 6% and 8%) and VD (5% and 10%) in the core of the fibers. Optimum fundamental parameters to produce core-shell fibers were voltage 14 KV and feed rate 0.5 mL/h. Consideration of SEM images revealed that coaxial fibers had ribbon-like, uniform and beadless morphology. Suitable fibers were produced using the mixture of 6% SPI/10% VD as the core, having the mean diameter of 723 nm. The core-shell structure was proved using TEM image. DSC/TGA analysis showed that coaxial fibers had more thermal resistance than emulsion ones and VD was well protected in the core of the fibers against destructive effects of the heat. FTIR spectra appeared that in both coaxial and emulsion fibers, VD was kept physically in the fibers’ matrix and no chemical interactions were happenedbetween it and other ingredients of the fibers. LC of the coaxial and emulsion fibers were measured 9.37% and 3.51% and EE were calculated 93.75% and 35.11%, respectively. These values indicated that VD was successfully encapsulated and protected by coaxial fibers. Consideration of VD release in lactate buffer it was evidenced that only 2.11% of total VD after 2h stirring in lactate buffer was released from coaxial fibers, whereas 91.0% of the VD was released from emulsion fibers. This event illustrated that VD was well protected in the coaxial fibers structure. The amount of released VD from coaxial and emulsion fibers in simulated gastric buffer were calculated 52.51% and 57.52%, respectively, and after final digestion in simulated intestinal buffer were reported 83.11% and 91.33%, respectively. Although, the ultimate amount of released VD from coaxial fibers was somewhat less than emulsion ones, but this amount was high enough and according to high stability of VD in the coaxial fibers’ structure due to full protection in the core of the fibers, it could be stated that coaxial electrospinning is an appropriate method for VD encapsulation in the SPI-zein core-shell fibers and release in the body. Studying VD release kinetics showed that for coaxial and emulsion fibers, VD release in gastric buffer followed by combination of diffusion and dissolution methods and in intestinal, gastro-intestinal and lactate buffers mainly, followed by diffusion. Key words: sunflower protein isolate, electrospinning, coaxial, hydrophobic, encapsulation, release, vitamin D.
پروتئین آفتابگردان یکی از باارزش ترین پروتئین های غذایی است که بخش اصلی کنجاله را تشکیل می دهد. این پروتئین به دلیل ایجاد کمپلکس قوی با ترکیبات فنولیک، مصرف غذایی ندارد و عمدتاً دور ریخته می شود، به طوریکه استفاده تجاری از آن صورت نمی گیرد. در تحقیق حاضر، ایزوله پروتئین آفتابگردان به روش رسوب ایزوالکتریک از کنجاله استخراج شد. با افزودن پلی وینیل الکل (محلول 8%) به محلول پروتئین آفتابگردان (محلول %6/16)، نانوالیاف پروتئینی تهیه شده و تأثیر دو پارامتر ولتاژ (KV 18 و23) و نرخ تغذیه (ml/h 5/0 و 75/0) و نیز اثر نسبت های مختلف پروتئین آفتابگردان/پلی وینیل الکل (0:100، 20:80، 40:60، 60:40، 80:20 و 100:0) بر قطر و شکل الیاف مورد بررسی قرار گرفت. الیاف یکنواخت و فاقد گره و شکستگی با استفاده از محلول پروتئین آفتابگردان/ پلی وینیل الکل به نسبت 40/60 در ولتاژ KV 18 و نرخ تغذیه ml/h 75/0 به دست آمد که قطر میانگین نانوالیاف در این شرایط 398 نانومتر بود. به منظور امکان کاربرد نانوالیاف در مواد غذایی، آبگریز کردن الیاف به کمک تیمار فیزیکی به وسیله حرارت دهی ( ° C150، h24)، تیمار شیمیایی توسط کلرید کلسیم (1%، 30 دقیقه غوطه وری) و ترکیب این دو تیمار، مورد مطالعه قرار گرفت و مشخص شد که تنها حرارت دهی موجب آبگریز کردن الیاف می شود، به طوریکه تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان داد که ساختار آنها در مدت 24 ساعت غوطه وری در بافر لاکتات کاملاً حفظ شد. بررسی زاویه تماس قطره آب روی سطح نانوالیاف نیز مشخص کرد که در اثر حرارت دهی، زاویه تماس از ° 40 به ° 110 افزایش یافت که تأیید دیگری بر آبگریز شدن الیاف حرارت دیده می باشد. با مقایسه طیف مادون قرمز و آنالیزهای حرارتی DSC/TGA نانوالیاف قبل و بعد از حرارت دهی نشان داده شد که حرارت دهی علاوه بر خروج مولکول های آب داخل ساختار، موجب ایجاد پیوند استری بین اسیدهای کربوکسیلیک پروتئین وگروه های هیدروکسیل پلی وینیل الکل شده که این واکنش، آبگریزی الیاف را افزایش می دهد. به منظور امکان ریزپوشانی ویتامینِ D، از فناوری الکتروریسی هم محور استفاده شد که زئین (محلول 20%) به عنوان یک پروتئین آبگریز و قابل الکترویسی، در قسمت پوسته و مخلوط پروتئین آفتابگردان (4%، 6% و 8%) و ویتامینِ D (5% و 10%)، در قسمت هسته الیاف مورد استفاده قرار گرفتند. شرایط مناسب برای الکتروریسی هم محور، ولتاژ KV 14 و نرخ تفذیه ml/h 5/0 تعیین شد. بررسی تصاویر میکروسکوپ SEM نشان داد که الیاف هم محور حاصله، تسمه ای شکل، یکنواخت و بدون گره بوده و مناسب ترین الیاف با استفاده از محلول 6% پروتئین و 10% ویتامینِ D به دست آمد که قطر میانگین آنها کمی بیش از700 نانومتر بود. ساختار هسته-پوسته الیاف هم محور به کمک میکروسکوپ TEM نشان داده شد. آنالیزهای حرارتی DSC/TGA نشان داد که الیاف هم محور مقاومت حرارتی بالاتری در مقایسه با الیاف مخلوط امولسیونی داشتند و نیز ویتامین کاملاً در داخل پوسته الیاف از اثرات مخرب حرارت حفظ شده بود. بررسی طیف مادون قرمز الیاف هم محور و مخلوط امولسیونی نشان داد که در هر دو حالت، ویتامینِ D به طور فیزیکی در ساختار الیاف حفظ شده بود و هیچگونه برهمکنش شیمیایی با اجزای دیگر برقرار نکرده بود. ظرفیت پوشانندگی (LC) الیاف هم محور و مخلوط امولسیونی به ترتیب %37/9 و %51/3 وکارایی ریزپوشانی (EE) آنها به ترتیب %75/93 و %11/35 محاسبه شد که بیانگر موفقیت الیاف هم محور در ریزپوشانی ویتامینِ D در مقایسه با الیاف مخلوط امولسیونی بود. بررسی رهایش ویتامینِ D در بافر لاکتات نشان داد که الیاف هم محور تنها حدود %11/2 از ویتامینِ D داخل ساختار را در محیط بافری آزاد کردند که این مقدار در مورد الیاف مخلوط امولسیونی %0/91 به دست آمد که %4/91 این مقدار، طی 2 ساعت اول هم زدن در محلول آزاد شد. این امر ثابت کرد که ویتامینِ D به خوبی در داخل ساختار الیاف هم محور حفظ شده است. میزان رهایش ویتامینِ D از الیاف هم محور و مخلوط امولسیونی در بافر شبیه سازی شده معده به ترتیب %51/52 و %52/57 و پس از پایان هضم در بافر مشابه روده به ترتیب %11/83 و %33/91 به دست آمد. با وجود آنکه مقدار نهایی ویتامین آزاد شده از الیاف هم محور، نسبتاً کمتر از الیاف مخلوط بود، اما این مقدار هنوز به حد کافی بالا بود و با توجه به پایداری بالای ویتامینِ D در ساختار الیاف هم محور به دلیل حفاظت کامل آن در داخل الیاف، می توان گفت که الکتروریسی هم محور روش مناسبی برای ریزپوشانی ویتامینِ D در داخل ساختار الیاف هسته-پوسته، پروتئین آفتابگردان-زئین و رهایش آن در داخل بدن محسوب می شود. با مقایسه روند رهایش ویتامینِ D از الیاف با مدل های موجود، می توان گفت در هر دو نوع الیاف هم محور و مخلوط، فرایند رهایش ویتامینِ D در بافر معده ای بر اساس ترکیب مکانیسم های انتشار و انحلال و در بافر روده ای، مسیر گوارشی و بافر لاکتات عمدتاً بر اساس انتشار می باشد. کلمات کلیدی: ایزوله پروتئین آفتابگردان، نانوالیاف، الکتروریسی، هم محور، آبگریز، ریزپوشانی، رهایش، ویتامینِ D، زئین، پلی وینیل الکل.