طراحی کیت تشخیصی برای ردیابی مالاشیت گرین در گوشت ماهی قزل آلای رنگین کمان پرورشی (Oncorhynchus mykiss)

STUDENT

DEGREE

YEAR

Rainbow trout have significant effects on human health due to their protein, unsaturated fatty acids, vitamins and micronutrients. However, consumption of rainbow trout containing residual malachite green (used as a disinfectant in fish farms) exacerbates the risk of cancer. Malachite green detection methods include high performance liquid chromatography and direct and indirect ELISA. The use of these methods has some limitations, such as a long test time, hard steps, high cost, the need for expert staff. Consequently, the development of diagnostic methods with high accuracy, sensitivity and speed is essential. A biosensor is an analytical device comprising a biological part and a physical transducer that generates a measurable signal at the analyte. Aptamer-based biosensors are tools that can use aptamers as biological receptors and identify target analytes. The aptamer binding to the target analyte is converted to a measurable signal transducer. The aim of this study was to select DNA aptamer for designing a biosensor to detect malachite green in the tissue of rainbow trout. For the purpose of this study, malachite green was first stabilized on Fe /alginate nanoparticles in optimum conditions such as temperature, pH and salt buffer. In order to select specific aptamers, Fe / alginate / malachite green nanoparticles were used as targets in a process called Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX). This process involves five steps: 1- Binding 2-Partitioning 3-Elution 4- Amplificatio 5- ssDNA generatio was repeated at thirteen consecutive rounds to begin the next round. The fragment of 13 th round of selection was cloned into pTG19 vector and sequenced. Based on the sequencing results, aptamer fragments of 13 th round were divided into seven distinct groups. Also, based on the binding percentage test, the three aptamers MG-A3, MG-A19 and MG-B10 had 100% binding for malachite green. Specificity test showed that aptamer MG-A19 had the highest specificity for malachite green and had the least interaction with similar (crystal violet) and non-similar compounds (Fe/ alginate nanoparticles). As a result, the MG-A19 fragment was used to design the Quartz Crystal Microbalance Biosensor (QCM). In this biosensor, small mass changes can be quantified by the reduction of the quartz crystal frequency. The MG-A19 aptamer was amplified using the biotin primer and stabilized by streptavidin on the surface of the microbalance quartz crystal. The limit of detection malachite green was determined 0.2 ng / ml. In addition, the recovery percentage of malachite green from fish tissue was achieved by 94%, indicating the high accuracy and efficiency of the quartz crystal microbalance biosensor.The results of this study showed that aptamer-based QCM biosensor can be used as a rapid, specific and high sensitive diagnostic method for the measurement of green malachite in tissue of rainbow trout. Keyword: Farmed rainbow trout, Aptamer, SELEX, Quartz Crystal Microbalance

ماهی قزل آلای رنگین کمان به دلیل داشتن پروتئین، اسیدهای چرب غیر اشباع، ویتامین و ریز مغذی ها بر سلامتی انسان اثرات قابل توجهی دارد. با این وجود مصرف ماهی قزل آلای رنگین کمان حاوی باقیمانده مالاشیت گرین(که عنوان ماده ضدعفونی کننده در مزارع پرورش ماهی استفاده می شود) خطر ابتلا به سرطان را تشدید می کند. روش های تشخیص مالاشیت گرین شامل روش های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و الایزای مستقیم وغیر مستقیم است. استفاده از این روش ها با برخی محدودیت ها از جمله زمان بر بودن آزمون، مراحل سخت، هزینه بالا ونیاز به نیروی متخصص همراه است. در نتیجه توسعه روش های تشخیصی با دقت، حساسیت و سرعت بالا ضروری است. زیست حسگر یک دستگاه تجزیه ای است که شامل قسمت تشخیص زیستی و مبدل فیزیکی است که سیگنال قابل اندازه گیری را نسبت به غلظت ترکیب هدف (آنالیت) ایجاد می کند. زیست حسگرهای مبتنی بر آپتامر، ابزارهایی هستند که می توانند از آپتامرها به عنوان گیرنده ی زیستی استفاده نموده و آنالیت هدف را شناسایی کنند. اتصال آپتامر به آنالیت هدف توسط یک مبدل به سیگنال قابل اندازه گیری، تبدیل می شوند. هدف از این پژوهش انتخاب آپتامرDNA برای طراحی زیست حسگر به منظور ردیابی مالاشیت گرین در بافت گوشت ماهی قزل آلای رنگین کمان پرورشی است. در راستای نیل به این هدف، ابتدا مالاشیت گرین بر نانوذرات آهن/آلژینات در شرایط بهینه دما،pH و بافر نمکی تثبیت شد. به منظور انتخاب آپتامرهای اختصاصی، نانو ذرات آهن/آلژینات/ مالاشیت گرین به عنوان هدف در فرآیندی به نام تکامل سیستماتیک لیگاندها از طریق غنی سازی تصاعدی یا SELEX مورد استفاده قرار گرفت. این فرایند شامل پنج مرحله ی 1- انکوباسیون و اتصال مجموعه قطعات آپتامر به مولکول هدف 2- تفکیک قطعات متصل شده به مولکول هدف از سایر قطعات اتصال نیافته 3- جداسازی قطعات متصل شده به مولکول هدف 4- تکثیر قطعات به دست آمده با استفاده از واکنش PCR 5- تولید مجدد قطعات تک رشته برای شروع دور بعدی SELEX، در سیزده دور متوالی تکرار شد. مجموعه قطعات حاصل از دور سیزدهم SELEX در ناقل pTG19 همسانه سازی و توالی یابی شد. بر اساس نتایج، قطعات آپتامر دور سیزدهم SELEX به هفت گروه مجزا تقسیم شدند. بر اساس آزمون درصد اتصال، سه آپتامر MG-A3، MG-A19 و MG-B10 از توانایی اتصال صد در صد برای مالاشیت گرین برخوردار بودند. بررسی اختصاصیت سه قطعه آپتامر نشان داد آپتامر MG-A19 بیشترین اختصاصیت را برای مالاشیت گرین و فرم احیایی آن (لوکومالاشیت گرین) داشته و کمترین برهمکنش را با ترکیبات مشابه (کریستال ویوله) و غیر مشابه (نانوذره آهن/آلژینات) دارد. در نتیجه قطعه مذکور برای طراحی زیست حسگر میکروبالانس کریستال کوارتز (QCM) استفاده شد. در این زیست حسگر، تغییرات اندک جرم به واسطه ی کاهش فرکانس کریستال کوارتز قابل اندازه گیری می باشد. آپتامر MG-A19 با استفاده از آغازگر بیوتینه تکثیر شد و به واسطه ی استرپتاویدین بر سطح کریستال کوارتز زیست حسگر تثبیت شد. حد تشخیص مالاشیت گرین توسط زیست حسگر طراحی شده 2/0 نانو گرم بر میلی لیتر به دست آمد. همچنین درصد بازیابی مالاشیت گرین از بافت ماهی توسط زیست حسگر میکروبالانس کریستال کوارتز 94% به دست آمد که حاکی از دقت و کارایی بالای آن برای تشخیص مالاشیت گرین از بافت ماهی است. نتایج این پژوهش نشان داد زیست حسگر QCM مبتنی برآپتامر می تواند به عنوان روش تشخیصی سریع، اختصاصی و با حساسیت بالا برای اندازه گیری مالاشیت گرین در بافت ماهی قزل آلای رنگین کمان پرورشی به کار برده شود. کلمات کلیدی: ماهی قزل آلای رنگین کمان، زیست حسگر میکروبالانس کریستال کوارتز، آپتامر،SELEX