ردیابی و تعیین خصوصیات مولکولی ویروس زردی نکروتیک باقلا(Faba bean necrotic yellows virus) در استان های مرکزی و غربی ایران

SUPERVISOR
محمدرضا لک (استاد مشاور) امیر مساح (استاد راهنما) علی اهون منش (استاد راهنما)
 
STUDENT
Mahsa Mansourpour
مهسا منصورپور

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1386

TITLE

Detection and Determination of Certain Molecular Properties of Faba bean necrotic yellows virus in Central and Western Provinces
Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV) causes severe yield losses and crop failure in fabaceous plants in western Asia and northern Africa. This virus belongs to Nanoviridae with a multipartite genome consisting of ten circular ssDNA components. FBNYV has been detected by TBIA method in chickpea and lentil in East Azerbaijan and West Azerbaijan, Qazvin, Kermanshah and Kordestan provinces. The main purpose of this research was detection and determination of certain molecular properties of FBNYV in central and western provinces of Iran. During a survey from 2008 to 2009 legume samples (chickpea, lentil, faba bean and common bean) showing yellowing, dwarfing and stem distortion were collected from Isfahan, Markazi, Chaharmahal-O-Bakhtiyari, Kermanshah, Kordestan and Lorestan provinces. The samples collected from Kermanshah, Kordestan and Lorestan provinces were tested by indirect-ELISA using a polyclonal antiserum. In indirect-ELISA seven out of 53 faba bean samples from Lorestan, six out of 56 chickpea samples from Kermanshah, three out of 18 chickpea samples from Kordestan and two out of six lentil samples from Kermanshah were tested positive. Total DNA was extracted from ELISA-positive samples and samples collected from Isfahan, Markazi and Chaharmahal-O-Bakhtiyari provinces. Nested-PCR was carried out using primers derived from the DNA-1 of Egyptian isolate of FBNYV. No visible band was detected in the first step of Nested-PCR reaction with DNA1F2/DNA1R2 primer pair. The expected PCR product (387 bp) was amplified in second step with DNA1F6/DNA1R4 primer pair in 17 out of 48 chickpea samples from Isfahan, four out of 22 common bean samples from Markazi and seven out of 12 common bean samples from Chaharmahal-O-Bakhtiyari. Eleven isolates representing different hosts and geographical regions including A5 and A13 (faba bean-Lorestan), D13 (chickpea-Kermanshah), M28 (lentil-Kermanshah), G10 (chickpea-Kordestan), SA4, SN9 and LN4 (chickpea-Isfahan), LG3 and LO4 (common bean Markazi) and SH5 (common bean-Chaharmahal-O-Bakhtiyari) were sequenced. The blast comparison revealed high similarity between nucleotide sequence of Iranian isolates and DNA1of Egyptian FBNYV isolate available at GenBank. Pairwise nucleotide sequence alignment of A5, A13, D13, G10, M28, SA4, SH5 and SN9 isolates with Egyptian and Syrian FBNYV isolates revealed 98/68, 98/55, 98/55, 97/39, 97/10, 96/23, 98/55, 97/39% and 74/68, 75/65, 75/65, 74/78, 74/49, 75/43, 75/65, 74/78% identity, respectively. These results show higher similarity between Iranian isolates and Egyptian isolate. Phylogenetic analysis confirmed closer relationship between Keywords : Faba bean necrotic yellows virus , Indirect ELISA, Nested-PCR
ویروس زردی نکروتیک باقلا Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV) باعث کاهش عملکرد شدید و فقدان محصول در گیاهان خانواده Fabaceae در غرب آسیا و شمال آفریقا می شود. این ویروس از خانواده Nanoviridae و دارای ده قطعه مولکول دی ان ای تک لای حلقوی متفاوت است. در ایران آلودگی به این ویروس از مزارع نخود و عدس در استان های قزوین، کرمانشاه،‌ کردستان،‌ آذربایجان شرقی و غربی با استفاده از روش TBIA گزارش شده است. هدف اصلی تحقیق حاضر ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس FBNYV در استان های غربی و مرکزی ایران می باشد. در سال های 1386و1387 از مزارع حبوبات استان های اصفهان،‌ مرکزی، چهارمحال و بختیاری، کرمانشاه، کردستان و لرستان با علائم زردی، کوتولگی و پیچیدگی ساقه نمونه برداری انجام شد. نمونه های جمع آوری شده از استان های کرمانشاه، کردستان و لرستان در آزمون الیزای غیرمستقیم با استفاده از آنتی سرم چند همسانه ای FBNYV مورد بررسی قرار گرفتند. در این آزمایش از 53 نمونه باقلای استان لرستان هفت نمونه، از 56 نمونه نخود استان کرمانشاه شش نمونه، از 18 نمونه نخود استان کردستان سه نمونه و از 6 نمونه عدس استان کرمانشاه دو نمونه مثبت ارزیابی شدند. از نمونه های جمع آوری شده از استان های اصفهان، مرکزی و چهارمحال و بختیاری و نیز نمونه های مثبت در آزمون الیزا استخراج DNA صورت گرفت. جهت تشخیص ویروس از روش Nested-PCR استفاده شد. بدین منظور طراحی آغازگرها بر اساس توالی DNA-1 جدایه مصری ویروس انجام شد. با استفاده از جفت آغازگرهای دور اول واکنش Nested-PCR (DNA1F2-DNA1R2) باند قابل مشاهده ای تکثیر نشد ولی در دور دوم با استفاده از جفت آغازگرهای DNA1F6-DNA1R4 باند مورد انتظارbp 387 در تعدادی از نمونه ها مشاهده شد. از 48 نمونه نخود جمع آوری شده از اصفهان 17 نمونه و از 22 نمونه لوبیای این استان چهار نمونه آلوده به ویروس بودند. همچنین از 56 نمونه لوبیای جمع آوری شده از استان مرکزی در 13 نمونه و از 12 نمونه لوبیای استان چهارمحال و بختیاری در هفت نمونه باند مورد نظر تکثیرشد. تعدادی از جدایه ها که نماینده میزبان ها و مناطق جغرافیایی مختلف بودند شامل A5 و A13 (باقلا- استان لرستان)، D13 (نخود-استان کرمانشاه)،‌ M28 (عدس-استان کرمانشاه)، G10 (نخود-استان کردستان)، SA4 ، SN9 و LN4 (نخود-استان اصفهان)، LG3 و LO4 (لوبیا- استان مرکزی) و SH5 (لوبیا-استان چهارمحال و بختیاری) توالی یابی شدند. مقایسه توالی این جدایه ها با ابزار جستجوی BLAST شباهت بالای آن ها را با توالی جدایه مصری FBNYV-DNA1 موجود در GenBank نشان داد. نتایج حاصل از همردیف سازی دو تایی نمونه ها با جدایه مصری FBNYV نشان داد که توالی نوکلئوتیدی نمونه های A5، A13K، D13، G10، M28، SA4، SH5 و SN9 به ترتیب دارای 68/98، 55/98، 55/98، 39/97، 10/97، 23/96، 55/98 و 39/97 درصد یکنواختی با جدایه مصری ویروس می باشند. همچنین درصد یکنواختی توالی نوکلئوتیدی این جدایه ها با جدایه سوری ویروس به ترتیب 68/74، 65/75، 65/75، 78/74، 49/74، 43/75، 65/75، 78/74 درصد بود که نشان دهنده کلمات کلیدی : ویروس زردی نکروتیک باقلا، الایزای غیرمستقیم، Nested-PCR

ارتقاء امنیت وب با وف بومی