تعیین برخی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی Potato leafroll virus وPotato virus A در استان اصفهان

STUDENT

DEGREE

YEAR

Potato is one of the most important crops in the world. Several viruses affect potato crop and cause significant economic losses. Potato leafroll virus (PLRV) is a member of genus Polerovirus and family Luteoviridae and Potato virus A is a member of genus Potyvirus and family Potyviridae are the most common viruses of potato. These viruses were transmitted in persistent and non-persistent manner by aphids, respectively. Since, in recent years, the PLRV and PVA are known as serious threats in potato fields of Iran and lack of enough information about molecular characteristics of them, this research was conducted to detect and determine the molecular characteristics of these viruses in Isfahan and Charmahal va Bakhtiari provinces. For this purpose, potato samples with symptoms of PLRV and PVA were collected in 2011 and 2012. Infection of samples with PVA symptoms including mild mosaic and leaf stunting were tested by double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA). In DAS-ELISA, 5 out of 32 leaf samples and 3 out of 35 tuber samples were tested positive. Total RNA was extracted from PVA positive samples and other samples showing PVA symptoms and were subjected to RT-PCR using PVA specific primer pairs PVAf/PVAr and Primer3-F/Primer4-R. The expected PCR products (255 bp and 1100 bp) were amplified in two samples. The amplicons were cloned and sequenced. No homology found in BLAST comparison between sequenced samples and PVA isolates available at GenBank. Because of presence of serological relationships between potyvirus species, it seems a virus different from PVA or at least a virus related to PVA was detected in DAS-ELISA. The extracted total RNA of samples showing PLRV symptoms including yellowing and leaf rolling was used in RT-PCR with PLRV0-F/PLRV0-R primer pair amplifying full length of PLRV ORF0. Some samples amplified expected size of 820bp. Amplified fragments of seven isolates representing different regions were selected and sequenced for molecular comparisons. The BLAST search revealed high similarity between ORF0 nucleotide sequence of the Iranian isolates and those of other PLRV isolates available at GenBank. Multiple alignment of the ORF0 amino acid sequence of PLRV Iranian isolates and those of PLRV isolates available at GenBank revealed high homology ranging from 90% to 100% among them. All Iranian isolates except Fereidan and Ben isolates showed highest Homology(99/1%-100%) with the Czech Republic (EU717546) and Egyptian (AY138970) isolates and lowest Homology (96/1%-96/9%) with Iranian isolate (JF914941), respectively. The Fereidan isolate showed highest Homology(98/7%) with the Germany (JQ346189) isolate and ben isolate showed highest Homology(100%) with Spanish (AF453389) isolates. Fereidan isolate showed lowest similarity(91/7%) with Cuba (AF453393) isolate. Phylogenetic analysis revealed almost all Iranian isolates grouped in one cluster and no clear assortment by geographical regions. Key word: Potato leafroll virus , Potato virus A , RT-PCR, Alignment, Phylogenetic tree.

سیب زمینی یکی از مهم ترین محصولات زراعی در جهان می باشد. ویروس های متعددی این گیاه را تحت تاثیر قرار می دهند و باعث خسارت اقتصادی قابل توجهی می شوند . ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی Potato leafroll virus (PLRV) عضو تیپ جنس Polerovirus و خانواده Luteoviridae و ویروس ای سیب زمینی Potato virus A (PVA) عضو تیپ جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae شایع ترین ویروس های سیب زمینی می باشند که توسط شته به ترتیب به طریق پایا و ناپایا منتقل می شوند . با توجه به اینکه در سال های اخیر ویروس های PLRV و PVA به صورت خطری جدی در سطح مناطق مختلف سیب زمینی کاری ایران، از جمله اصفهان مطرح می باشند و از آنجا که اطلاعات کافی در مورد خصوصیات مولکولی این ویروس ها موجود نمی باشد ، به منظور ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس ها در تابستان سال های 1390 و1391 از مزارع سیب زمینی استان های اصفهان و چهار محال و بختیاری نمونه های دارای علایم دو ویروس PLRV و PVA جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. آلودگی تعدادی از نمونه های دارای علایم PVA شامل موزاییک خفیف و ریز برگی در 32 نمونه برگ و 35 غده با استفاده از آزمون ELISA DAS- بررسی شد. از نمونه های بررسی شده با آزمون الیزا، پنج نمونه برگ وسه نمونه غده، آلودگی مثبت به ویروس PVA نشان دادند. از این نمونه ها به همراه تعدادی دیگر از نمونه های دارای علایم PVA، RNA کل استخراج شد و در آزمون RT-PCR با جفت آغازگرهای PVAf/PVAr وPrimer3-F/Primer4-R بررسی شدند. تنها دو نمونه قطعه های مورد انتظار bp255 و bp1100 را تکثیر کردند. قطعات DNA تکثیر شده، همسانه سازی و تعیین توالی شدند. نتیجه حاصل از جستجوی BLAST متعلق بودن قطعه های تکثیر شده به PVA را تایید نکرد. به دلیل وجود ارتباط سرولوژیکی بین گونه های مختلف اعضای جنس پوتی ویروس، امکان ردیابی ویروسی دیگری به جای PVA و یا حداقل ویروسی مرتبط با آن در آزمون الیزا محتمل به نظر می رسد. نمونه های دارای علایم ویروسPLRV شامل زردی و پیچیدگی برگ ها و بوته های به ظاهر سالم به همراه جوانه غده ها با جفت آغازگر PLRV0-F/PLRV0-R که اندازه تمام طول ORF0 ویروس را تکثیر می کنند، بصورت مستقیم تحت واکنش RT-PCR قرار گرفتند. تکثیر قطعه مورد انتظار bp820 در تعدادی از نمونه های برگ و غده، آلودگی ویروس PLRV را تایید نمود. به منظور انجام مقایسات مولکولی قطعات تکثیر شده هفت جدایه شامل جدایه هایی از فریدن، داران، درچه، نودرآمد، جوهرستان، مبارکه و بن(شهرکرد) توالی یابی شدند . نتایج حاصل از جستجوی بلاست شباهت بالای آن ها را با توالی جدایه های LRVموجود در بانک ژن نشان داد. همردیف سازی توالی آمینواسیدی ORF0 جدایه های ایرانی PLRV با جدایه های موجود در بانک ژن نشان دهنده میزان تشابه بالا بین آن ها از 7/91% تا 100% بود . بطوریکه تمامی جدایه های ایرانی به جزجدایه بن (شهرکرد) و فریدن بالاترین میزان همولوژی (100%-1/99%) را با جدایه هایی از جمهوری چک با شماره دسترسی EU717546 و مصر با شماره دسترسی AY138970 نشان دادند . جدایه بن بالاترین میزان همولوژی(100%) را با جدایه ای از اسپانیا با شماره دسترسی AF453389 نشان داد و جدایه فریدن بیشترین شباهت (7/98%) را با جدایه ای از آلمان با شماره دسترسی JQ366189 داشت. همچنین همه جدایه های ایرانی به جز جدایه فریدن کمترین تشابه (1/96%-9/96%) را با جدایه ای از ایران با شماره دسترسی JF914941 نشان دادند و جدایه فریدن کمترین تشابه(7/91%) را با جدایه ای از کوبا با شماره دسترسی AF453393 نشان داد . رسم درخت تبارزایی جدایه های ایرانی و جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که همه جدایه های ایرانی به جز جدایه فریدن در یک گروه قرار گرفتند و هیچگونه تفکیکی بر اساس منطقه جغرافیایی صورت نگرفت.