شناسایی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروییدهای مو در استان های اصفهان، مرکزی، چهارمحال و بختیاری و یزد

STUDENT

DEGREE

YEAR

Viroids are the smallest plant pathogens consisting a single stranded RNA molecule and cause destructive diseases in plants. So far, five viroids species including Grapevine yellow speckle viroid- 1 (GYSVd-1) , Grapevine yellow speckle viroid- 2 (GYSVd-2), Hop stunt viroid (HSVd), Australian grapevine viroid (AGVd) and Citrus exocortis viroid (CEVd) have been identified in grapevine. There is no available information on distribution and molecular properties of grapevine viroids in central provinces of Iran. In 2012, grapevine leaves showing vein banding and yellow speckle symptoms and symptomless samples were collected from Isfahan, Chaharmahal va Bakhtiari, Yazd and Markazi provinces. Total RNA was extracted from grapevine leaves and subjected to RT-PCR using the following specific primer pairs including GYSVd1-mf/GYSVd1-mr, GYSVd1_H/GYSVd1 c4+, GYSVd1_H/GYSVd1_C/GYSVd1c4+, GYSVd2 h1+/GYSVd2 c1-, HSVd h2+/HSVd c3-, HSVd _87P/HSVd_83M, AGVd h2+/AGVd c2- and AGVd h1+/AGVd c1-. The expected PCR products confirm infection of samples to GYSVd1, GYSVd2, HSVd and AGVd in RT-PCR. Forty, 33, 46 and 120 out of 120 collected samples were infected to GYSVd2, AGVd, GYSVd2 and HSVd, but none of them amplified expected PCR products of CEVd. For simultaneous detection of grapevine viroids, multiplex RT-PCR was carried out using the primer pairs mix containing GYSVd1-mf/GYSVd1-mr, GYSVd2 h1+/GYSVd2 c1-, HSVd _87P/HSVd_83M and AGVd h2+/AGVd c2-. The expected size of PCR products (130bp for AGVd, 250 bp for GYSVd2, 300 bp for HSVd and 370 bp for GYSVd1) were amplified in multiplex RT-PCR. The PCR products or cloned of full length sequences of 23 isolates of different viroids representing different geographical regions were sequenced. Multiple alignments revealed high homology (more than 90%) between Iranian viroid isolates and other viroid isolates available at Genbank. The Meyme and Khatam isolates of AGVd showed the highest (99.7%) and the lowest (97.3%) homology with the Maragheh isolate (JQ686701) and Iranian isolate (FJ940923), respectively. The highest (100%) and lowest (92.3%) homology were found between Saman, Mahallat and Shahreza isolates of HSVd and china isolate (DQ371459) and between Khatam isolate and Iranian isolate (JX430795). The Meyme, Mahallat and Shahreza isolates of GYSVd1 showed the highest homology (97.8%) with Italian isolate (AF462167) and the lowest homology (95.1%) was found between Gahro isolate of GYSVd1and China (GU170805), Iran (JN008866) and Italian (AF462167) isolates. The Gahro isolate of GYSVd2 showed the highest homology (99.4%) with china (DQ377131) and Meymeh and Tiran isolates of GYSVd2 showed the lowest homology (98.3%) with Iranian isolate (JN008867). Phylogenetic analyses based on Neighbor-Joining method revealed no separation based on geographical regions. These results showed high incidence of grapevine viroids in central provinces of Iran and high nucleotide homology between isolates of central provinces of Iran and other isolates available at GenBank. Key Words: Grapevine yellow speckle viroid- 1 . Grapevine yellow speckle viroid- 2 , Hop stunt viroid. Australian grapevine viroid, Molecular properties.

ویروییدها به عنوان کوچکترین بیمارگرهای گیاهی ، از یک مولکولRNA حلقوی تشکیل شده و بیماری های مخربی را در گیاهان ایجاد می کنند. تا کنون در مو پنج ویرویید شامل ویرویید لکه زرد مو1 G rapevine yellow speckle viroid- 1 (GYSVd-1)، ویرویید لکه زرد مو2 Grapevine yellow speckle viroid- 2 (GYSVd-2)، ویرویید کوتولگی رازک Hop stunt viroid (HSVd)، ویرویید استرالیایی مو Australia grapevine viroid (AGVd) و ویرویید اگزوکورتیس مرکبات Citrus exocortis viroid (CEVd) شناسایی شده اند. با توجه به عدم وجود اطلاعات در مورد پراکندگی و خصوصیات مولکولی این ویروییدها در استان های مرکزی ایران نمونه برداری از تاکستان های چهار استان اصفهان، چهارمحال و بختیاری، یزد و مرکزی در بهار و تابستان 91 بر اساس علایم لکه زردی و رگبرگ زردی برای دو ویرویید GYSVd1 و GYSVd2 و در مورد سه ویرویید دیگر با توجه به اینکه فاقد علایم می باشند، به صورت تصادفی انجام شد. RNA کل از برگ های جمع آوری شده استخراج شد و به عنوان الگو درآزمون RT-PCR با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی ویرویید های مو شامل GYSVd1-mf/GYSVd1-mr1، GYSVd1_H/GYSVd1 c4+، GYSVd1_H/GYSVd1_C /GYSVd1 c4+، GYSVd2 h1/GYSVd2 c1-، HSVd h2+/HSVd c3-، HSVd_87/HSVd_83M، AGVd h2+/AGVd c2- و AGVd h1+/AGVdc1- استفاده شد. در آزمون RT-PCR از بین 120 نمونه جمع آوری شده به ترتیب 120 ، 33، 46 و 40 نمونه به HSVd، AGVd ، GYSVd-1 و GYSVd-2 آلوده تشخیص داده شدند. همچنین هیچ نمونه ای آلوده به CEVd شناسایی نگردید. آزمون multiplex RT-PCR برای شناسایی هم زمان چهار ویرویید AGVd، HSVd، GYSVd-1 و GYSVd-2 توسط مخلوطی از آغازگرهای GYSVd1-mf/GYSVd1-mr1، GYSVd2 h1/GYSVd2 c1-، HSVd_87/HSVd_83M و AGVd h2+/AGVd c2- انجام شد و باند های bp130، bp250، bp 300 و bp 370 به ترتیب مربوط به AGVd، GYSVd-2، HSVd و GYSVd-1 مشاهده گردید. محصول PCR یا همسانه تمام طول ژنوم مربوط به 23 جدایه از ویرویید های مو از مناطق مختلف جغرافیایی انتخاب و تعیین توالی شدند. نتایج حاصل از هم ردیف سازی نشان دهنده میزان تشابه بالا (بیش از 90%) بین جدایه های توالی یابی شده با جدایه های موجود دربانک ژن بود. جدایه های میمه و خاتم AGVd بیشترین (7/99%)و کمترین (3/97%) میزان تشابه را به ترتیب با جدایه مراغه با شماره دسترسی JQ686701 و جدایه ایران با شماره دسترسی FJ940923 نشان دادند. بیشترین و کمترین میزان تشابه جدایه های HSVd مربوط به جدایه سامان ، محلات و شهرضا با جدایه ای از چین با شماره دسترسی DQ371459 و جدایه خاتم با جدایه ایران با شماره دسترسیJX430795 به ترتیب به میزان 100% و 3/92% بود. در جدایه های GYSVd1 بیشترین میزان تشابه مربوط به جدایه های محلات، میمه و شهرضا با جدایه ای از ایتالیا با شماره دسترسیAF462167 به میزان 8/97% وکمترین میزان تشابه مربوط به جدایه گهرو با سه جدایه از چین، ایران و ایتالیا به ترتیب با شماره های دسترسی GU170805، JN008866 و AF462167 به میزان 1/95% بود. جدایه گهرو GYSVd2 بیشترین میزان تشابه را با جدایه ای از چین با شماره دسترسی DQ377131 به میزان 4/99% و کمترین میزان تشابه را جدایه های میمه و تیران با جدایه ایران با شماره دسترسی JN008867 به میزان 3/98% نشان دادند. درخت تبارزایی بر اساس توالی تمام طول ژنوم ویروییدها به روش Neighbor -Joining با 10000 بار تکرار رسم شد. نتایج حاصل از درخت تبارزایی نشان دهنده عدم تفکیک جدایه های ویروییدی بر اساس منطقه جغرافیایی بود. نتایج حاصل از این تحقیق پراکندگی بالای ویروییدهای مو در استان های مرکزی ایران و میزان تشابه بالای نوکلئوتیدی آن ها با سایر توالی های موجود در بانک ژن را نشان داد. کلمات کلیدی: ویرویید لکه زرد 1 مو، ویرویید لکه زرد 2 مو ، ویرویید کوتولگی رازک، ویرویید استرالیایی مو، خصوصیات مولکولی