ارزیابی سمیت کل هیدروکربنهای نفتی (TPHs) در محیطهای آبی با استفاده از باکتری نورافشان Vibrio fischeri

STUDENT

DEGREE

YEAR

Petroleum hydrocarbons are one of the important sources of energy and a raw material for various industries. Anthropogenic activities such as industrial and municipal runoffs, petroleum industrial activities as well as accidental spills cause petroleum hydrocarbon pollution. Petroleum hydrocarbons are the most complex and variable mixture to evaluate toxicologically due to its many compounds. Thus, it is of great importance to monitor oil pollution especially using bioindicators. Living organisms such as bioluminescent bacteria are widely used as an indicator of environmental quality monitoring. Bacterial bioluminescence reflects the metabolic status of the cell; i.e., toxic substance prevents the metabolic activity of the cell via the electron traort chain inhibition. This study aimed to investigate the effect of petroleum hydrocarbons on bioluminescent bacteria. In the present work, water samples were collected from five points on the coasts of Arvand Rud and Imam Khomeini Port and transferred to the laboratory. Then, physico-chemical properties of water samples were measured. Water samples were cultured on solid medium to isolate the bacteria by which eight bacterial strains were isolated and purified. Three methods were used to evaluate the bioluminescence of the bacteria. The bacteria were first placed in a dark room and after a few minutes of eye acclimation to darkness, were examined. Other methods were included the use of PMT and fluorescence microscopy. The results of these tests showed none of the bacteria could be considered as a luminescence strain. Hence, in the follow-up studies, the bacterium Vibrio fischeri was provided from Persian Type Culture Collection. Growth pattern of the bacteria were first examined to reach the optimal growth. The optimum temperature and pH were also determined for V. fischeri and other isolates. The results demonstrated the proper time for bacteria growth was 16 hours after inoculation and optimum temperature and pH were 25 °C and 7, respectively. In order to investigate the crude oil toxicity, the water-soluble fraction was first provided. Then, different methods were used to evaluate the toxicity of petroleum compounds. In the first method, different oil concentrations were prepared in different proportions of the prepared oil solution and photobacterium broth medium. In the second method, crude oil with sodium dodecyl sulfate was poured as an oil layer on a certain amount of sterile medium with different concentrations. In the third method, the short-term and long-term toxicity tests were conducted. Short-term toxicity did not show toxicity for any of the treatments. Long-term toxicity showed no significant difference for luminescence of the samples either. Thus, in the fourth method, the growth and luminescence kinetics of V. fischeri were examined. Investigation of the luminescence kinetics showed the appropriate time for the long-term toxicity was 6 hours. Overall, the results revealed that Increased toxicity and reduced luminescence with increasing concentration. The EC50 value of this study was obtained 1.77 mg/L, showed relatively high sensitivity in comparison with similar organic compounds. Therefore, the mentioned approach can be used for monitoring of petroleum pollutants in aqueous media. Keywords: Bioassay, Bioluminescence inhibition, EC50, Toxicity monitoring, Water

هیدروکربنهای نفتی یکی از منابع مهم انرژی و ماده خام اولیه برای بسیییاری از صیینایع هسییتند. فعالیت های انسییانی مانند روانابهای صینعتی و شیهریف فعالیت صینایع نفتی واقع در خشیکی و دریا و همچنین نشیت های تصیادفی منجر به آلودگی نفتی می شوند. این آلودگی محیط زیسیت را تیییر داده و به طور مسیتقیم یا غیر مسیتقیم بر سیلامت تمام اشیکال حیات روی سیاره زمین اثر می گذارد. هیدروکربنهای نفتی به عنوان آلایندههای آلی اولویتدارف پیچیدهترین و متییرترین مخلوط برای ارزیابی سییمشییناسییی به علت دارا بودن ترکیبات متعدد میباشیند. بنابراین پایش آلودگی نفتی به ویژه با اسیتفاده از شاخص های زیستی حائز اهمیت است. استفاده از موجودات زنده به عنوان یک شییاخص برای پایش کیفیت محیطی به طور گسییترده مورد اسییتفاده قرار میگیرد. از جمله این موجودات میتوان به باکتریهای نورافشییان )بیولومینسیینت( اشییاره کرد. بیولومینسییانس باکتریایی وضییعیت متابولیک سییلول را منعکس می کند؛ بدین معنی که با مهار زنجیره انتقال الکترون مانع از فعالیت متابولیک سیلول می شیود. در نتیجه در صورت حضور مواد سمی لومینسانس کاهش مییابد. لذا این مطالعه با هدف بررسیی تاثیر هیدروکربن های نفتی بر باکتریهای نورافشیان انجام شید. در پژوهش حاضیر ابتدا نمونه های آب از پنج نقطه واقع در سواحل اروندرود و بندر امام خمینی )اسیتان خوزسیتان( جمع آوری گردید و برای مطالعات بیشیتر به آزمایشیگاه منتقل شیدند . سیسس خص وصیات فیزیکوشییمیایی نمونههای آب اندازهگیری گردید. به منظور جداسازی باکتریهاف نمونههای آب در محیط کشت جامد کشت داده شدند. در این مطالعه تعداد 1 سیویه باکتریایی جداسیازی و خالص سیازی شید. برای بررسی بیولومینسانس باکتری ها از سه روش استفاده شد. ابتدا باکتریها به یک اتاق تاریک منتقل شیدند و پس از چند دقیقه انطباق چشیم با تاریکی بررسی شدند که هیچ یک از باکتریها به این تست جواب مثبت ندادند. روشهای دیگرف استفاده از دستگاه PMT و میکروسکوپ فلوئورسانس بود. نتایج این آزمایشات نیز نشان داد که هیچ یک از باکتریها را نمیتوان به عنوان گونه نورافشییان جداسییازی کرد. بنابراین در ادامه مطالعاتف اقدام به تهیه باکتری ویبریو فیشییری از مرکز کلکسیون میکروارگانیسمهای صنعتی ایران شد. در وهله اول برای دستیابی به رشد بهینه باکتریهاف الگوی رشد آنها بررسی گردید. همچنین دما و pH بهینه برای باکتری ویبریو فیشیری و سیایر باکتری های جداسیازی شیده مشیخص گردید. نتایج نشان داد که زمان مناسب برای رشید باکتری ها 26 سیاعت پس از تلقیح و دما و pH بهینه به ترتیب 11 درجه سیانتی گراد و 7 بود. برای بررسیی سینجش سمیت نفت خامف ابتدا بخش قابل حل نفت در آب تهیه شید. سسس به منظور بررسی سنجش سمیت ترکیبات نفتی از روشهای مختلف استفاده گردید. در روش اول غلظتهای مختلف نفتی در نسییبتهای مختلف محلول نفت و محیط کشییت فتوباکتریوم براث تهیه شیید. در روش دوم نفت خام به صیورت یک لایه نفتی بر روی م یزان مشیخصیی از محیط کشیت اسیتریل شده با غلظت های متفاوت ریخته شد. سسس به میزان نفت ریخته شیدهف سیدیم دودسییل سیولفات به عنوان سورفکتانت نیز به منظور حل کردن بخش قابل حل نفت خام اضافه گردید. در روش سوم سینجش سیمیت کوتاه مدت ) 21 دقیقه( و بلند مدت ) 26 سیاعت( انجام شید. سمیت کوتاه مدتف سمیت را برای هیچ یک از تیمارها نشان نداد. سییمیت بلند مدت نیز تفاوت معنیداری برای لومینسییانس نمونهها نشییان نداد. بنابراین در روش چهارم سییینتیک رشیید و لومینسییانس باکتری ویبریو فیشیری بررسیی شید. بررسیی سیینتیک لومینسیانس نشان داد زمان مناسب برای آزمون بلند مدت 6 ساعت بود. به طور کلی نتایجف افزایش سیمیت و کاهش لومینسیانس را با افزایش غلظت نشیان داد. مقدار 50EC 2 میلیگرم بر لیتر به دست / حاصل از این مطالعه 77 آمد که در مقایسیه با ترکیبات آلی مشابه حساسیت نسبتاً زیادی را نشان داد. بنابراین روش مذکور به عنوان یک راهکار مناسب برای پایش آلایندههای نفتی در محیطهای آبی میتواند قابل کاربرد باشد. کلمات کلیدی: