ساخت و مشخصه يابي داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات/هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت جهت مهندسي بافت استخوان

STUDENT

DEGREE

YEAR

The aim of this research was the fabrication and characterization of poly (hydroxybutyrate co valerate) (PHBV) nanofibrous scaffolds containing hydroxyapatite (HA)/bredigite (BR) nanoparticles for bone tissue engineering. Hydroxyapatite/bredigite nanoparticles were synthesized using sol-gel method and its structural and morphological properties were characterized by using XRD, SEM, TEM, FTIR techniques. The results of in vitro bioactivity and cytotoxicity assessments revealed that the presence of bredigite enhanced the bioactivity and biocompatibility of composite nanoparticles. PHBV nanofibrous scaffolds containing HA, BR and HA/BR nanoparticles were fabricated using electrospinning method and characterized using SEM, TEM, DSC and FTIR. The evaluation of mechanical properties of PHBV scaffolds demonstrated that addition of nanoparticles up to 10% increased Young Modulus and tensile strength of scaffolds. Thus PHBV nanofibrous scaffolds containing 10% of HA, BR and HABR have been chosen for the rest of studies. The results of in vitro biodegradation study in buffer phosphate and in vitro bioactivity assessments in simulated body fluid revealed that the presence of all different nanoparticles improved the biodegradation and bioactivity of PHBV nanofibrous scaffolds. However PHBV scaffolds containing BR and HABR nanoparticles exhibited higher degradation and apatite formation rate than PHBV containing HA nanoparticles. In order to improve the wettability of PHBV composite nanofiber, poly l lysine (PLL) was added to PHBV scaffolds through two methods: 1) covalent attachment using EDC/NHS and 2) blending with PHBV nanofiber. The results of water contact measurements showed that water contact angle decreased from 129 to 52 degree as a result of PLL addition. The surface roughness of composite scaffold before and after treatment with PLL was study using AFM. Mean surface roughness for PHBV, PHBV/HABR, PHBV/HABR modified with PLL and PHBV/HABR blended with PLL were reported to be 329, 349, 345 and 392.9 respectively. Studies on cell–scaffolds interaction were carried out by culturing human fetal osteoblast (hFOB) cells on the scaffolds. Results of MTS study revealed the higher cells proliferation on PHBV/HABR modified with PLL scaffolds compared to other samples. PHBV/HABR modified with PLL also showed higher mineral deposition on the hFOB cells than other samples. Cell differentiation identified by alkaline phosphatase activity was significantly higher on PHBV/HABR modified with PLL compared to other scaffold. All of these results suggest that the produced PHBV/HABR modified with PLL nano?brous scaffold would be a promising candidate as an osteoconductive material for tissue engineering applications.

هدف از اين تحقيق، طراحي، ساخت و مشخصه يابي داربست هاي نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات حاوي نانوذرات هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت جهت کاربرد در مهندسي بافت استخوان بود. ابتدا نانوذرات بريديجيت و هيدروکسي آپاتيتي/ بريديجيت (حاوي 25 و 50% وزني بريديجيت) به روش سل-ژل ساخته و خواص ساختاري و مورفولوژيکي آن با بکارگيري تکنيک هاي پراش پرتو ايکس، ميکروسکوپ الکتروني روبشي و عبوري و طيف سنجي تبديل فوريه بررسي شد. زيست فعالي و زيست سازگاري نانوذرات هيدروکسي آپاتيت/ بريديجيت ارزيابي شد و نتايج نشان داد که حضور نانوذرات بريديجيت زيست فعالي و زيست سازگاري نانوذرات کامپوزيتي را نسبت به نانوذرات هيدروکسي آپاتيت خالص بهبود بخشيد. داربست هاي نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات نانوذرات هيدروکسي آپاتيت، هيدروکسي آپاتيت/ بريديجيت و يا بريديجيت به روش الکتروريسي تهيه شد. ريز ساختار و خواص فيزيکوشيميايي داربست هاي ساخته شده با بکارگيري تکنيک هاي ميکروسکوپ الکتروني عبوري و روبشي، کالريمتري افتراقي و طيف سنجي تبديل فوريه مطالعه و ارزيابي شد و خواص مکانيکي داربست هاي نانوليفي مثل استحکام کششي، ضريب يانگ و ازدياد طول تا حدپارگي، اندازه گيري و تعيين شد. نتايج نشان داد که در غلظت 10% از هر سه نوع نانوذره، داربست هاي نانوليفي کامپوزيتي بيشترين مقدار ضريب يانگ و استحکام کششي نهايي را داشتند. به همين دليل، داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات حاوي 10% نانوذره (هيدروکسي آپاتيت، هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت و يا بريديجيت) براي ادامه مطالعات انتخاب شد. همچنين نتايج آزمون مکانيکي نشان داد که ضريب يانگ و استحکام کششي نهايي داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات حاوي 10% هيدروکسي آپاتيت و داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات حاوي 10% هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت از نظر آماري بطور معني داري بالاتر از ضريب يانگ و استحکام کششي نهايي داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات حاوي 10% بريديجيت بود. نتايج ارزيابي هاي زيست تخريب پذيري در محيط بافر فسفات و زيست فعالي در مايع شبيه سازي شده بدن، گوياي اين بود که حضور هر سه نوع نانوذره، زيست تخريب پذيري و زيست فعالي داربست پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات را بهبود بخشيده، درحالي که داربست هاي نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-بريديجيت و پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت نرخ تخريب پذيري بيشتر و زيست فعالي بالاتري نسبت به داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت داشتند. داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت به دليل دارا بودن خواص مکانيکي و زيست فعالي برتر نسبت به نمونه هاي حاوي هيدروکسي آپاتيت و يا بريديجيت، براي ادامه مطالعات انتخاب و استفاده شد. به منظور بهبود آبدوستي و چسبندگي سلولي داربست هاي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات، بيوپليمر پلي ال لايزين از دو طريق 1) اتصال کووالانسي به روش NHS-EDC و 2) مخلوط کردن در حين اجراي عمليات الکتروريسي، به داربست پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت افزوده شد. نتايج اندازه گيري زاويه تماس آب نشان داد که بعد از بگارگيري پلي ال لايزين، زاويه تماس آب بر روي داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات از 129 درجه به 52 درجه کاهش يافت. زبري سطح داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات با بکارگيري تکنيک ميکروسکوپ نيروي اتمي مورد مطالعه قرار گرفت و متوسط زبري سطح داربست هاي نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات، پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت، پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت -پلي ال لايزين و پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت اصلاح سطحي شده با پلي ال لايزين، به ترتيب برابر 329، 349، 345 و 9/392 نانومتر تعيين شد. به منظور بررسي تکثير سلولي، فعاليت فسفاتاز قليايي و ميزان مينراله شدن سلولي، سلول هاي استئوبلاست جنين انسان (hFOB) بر روي نمونه هاي نانوليفي کشت داده شدند. نتايج آزمون تکثير سلولي MTS نشان داد که رشد سلول هاي hFOB بر روي داربست پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت اصلاح سطحي شده با پلي ال لايزين بعد از 15 روز کشت سلول، از نظر آماري به طور معني داري بيشتر از ساير نمونه ها بود. نتايج آناليز ميکروسکوپ الکتروني روبشي-طيف سنجي توزيع انرژي پرتوايکس و رنگ آميزي آليزارين رد-اس نيز تشکيل تجمعات بيشتر مينرال را بر روي سلول هاي کشت داده شده بر روي داربست پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت اصلاح شده با پلي ال لايزين نشان داد که بيان کننده شرکت تعداد بيشتري از سلول هاي hFOB در فرآيند تشکيل ماتريکس خارج سلولي مينراله مي باشد. نتايج همچنين نشان داد که فعاليت فسفاتاز قليايي سلول هاي hFOB بر روي داربست نانوليفي اصلاح شده با پلي ال لايزين بيشتر از ساير نمونه hy;هاي نانوليفي بود. بنابراين با استناد به نتايج حاصل، داربست نانوليفي پلي هيدروکسي بوتيرات کوهيدروکسي والرات-هيدروکسي آپاتيت/بريديجيت اصلاح سطحي شده با پلي ال لايزين مي تواند کانديداي مناسبي براي کاربردهاي مهندسي بافت استخوان باشد.