Skip to main content
SUPERVISOR
Aghafakhr Mirlohi,Rahim Mehrabi,Azar Shahpiri
اقافخر میرلوحی فلاورجانی (استاد مشاور) عبدالرحیم مهرابی (استاد مشاور) آذر شاه پیری (استاد راهنما)
 
STUDENT
Zahra Majnoun
زهرا مجنون

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1395

TITLE

Cloning and overexpression of gene encoding chromate reductase (YieF) in Escherichia coli
Chromium is a toxic metal with oxidation numbers ranging from –2 to +6. Nonetheless Cr (VI) and Cr (III) are two commonly existing stable oxidation states of chromium in the environment. The Cr (VI)-made-compounds are generally more soluble, mobile, and bioavailable in the environment in comparison with Cr (III)-made-compounds. Besides, chromium (VI) is a notorious inhaled carcinogen and leads to severe health problems ranging from simple skin irritation to lung carcinoma. The elimination of chromium from the environment can be achieved by dint of various chemical and physical approaches. However, the high-energy demands, incomplete elimination, production of toxic sludge are some of disadvantages of these technologies. In recent years, bioremediation has become one of the alternative methods which are of broad appeal through people owing to its high efficiency, low cost and its ecofriendly nature. Hence, the transformation of Cr (VI) to the non-toxic Cr (III) using chromium resistant bacteria offers an affordable and cost-effective option concerning chromate detoxification. In the present work, a gene encoding a chromate reductase named YieF, was overexpressed in E.coli . To this end the gene encoding YieF was amplified from the genome of E. coli by PCR. Then the PCR product was cloned in the expression vector pCDFduet under the promoter T7. The construct pCDFduet-YieF was transformed in E. coli strain Rosetta (DE3) resulted in production of a new strain named R-YieF. The heterologous expression of YieF as a His.tag fusion protein was confirmed in the soluble fraction of E. coli by SDS-PAGE. The comparison of growth curve and determination of the amount of eliminated Cr 6+ in the medium of R-YieF and the control strain showed that the over-expression of YieF has a significant effect on the accumulation of Cr 6+ . In addition we co-expressed YieF with a rice metallothionein isoform (OsMT1) in E. coli . Therefore the construct PCDFduet-YieF together with the previous- made construct pET41a-OsMT1 were transformed in E. coli strain Rosetta (DE3). The new strain was named R- YieF-MT1. The heterologous expression of both His-YieF and GST-OsMT1 were confirmed in the soluble fraction of this strain. Finally the growth curve of the strains R-MT1, R-YieF, R-YieF-MT1 and control strain was compared when the strains were grow up in the medium in the presence of 2 mM Cr 6+ . The results show that the OD after 12 h in the all three transgenic strain was more than control strain. The accumulation of Cr6 + in the new strains as well as control was determined during 0, 2, 6 and 10 h after addition of IPTG and Cr 6+ to the medium. The results showed that the accumulation of Cr 6+ increase in the strains during time. However the amount of accumulation between strains are different and is in order of R-MT1-YieF R-YieF R-MT1 Control which indicate the significant effect of co-expression of MT1 and YieF in the elimination of Cr 6+ . The absorption isotherm showed amount of accumulation of Cr 6+ in the strain R-MT1-Yied is dependent on the primary concentration of Cr 6+ . However the absorption was remained constant when the primary concentration was reached to 3 mM. Keywords : heavy metals, chromium, metallothionein, chromate reductase, protein expression
کروم یک فلز سمی با درجه اکسیداسیون 2-6 است. با این حال، Cr (VI) و Cr (III) دو شکل رایج اکسیداسیون کروم در محیط هستند. ترکیبات ساخته شده از Cr (VI) به طور کلی دارای حلالیت بیشتر و در نتیجه حرکت بیشتر در محیط زیست در مقایسه با ترکیبات Cr (III) هستند. علاوه بر این، Cr (VI) یک فلز سرطان زا است که منجر به مشکلاتی مانند سوزش پوست، آلرژی و سرطان ریه در انسان هایی که در معرض این فلز هستند شده است. برای حذف کرومات (Cr 6+ ) از محیط زیست تا کنون روش های مختلف شیمیایی و فیزیکی به کار برده شده است. با این حال، نیاز به انرژی بالا، حذف ناقص فلزو تولید لجن سمی از معایب این فنا وری ها است. در سال های اخیر، زیست پالایی به یکی از روش های جایگزین تبدیل شده است که به دلیل راندمان بالا، هزینه های پایین و ماهیت سازگاری آن با محیط زیست از جذابیت بالایی برخوردار است. از این رو، تبدیلCr 6+ به Cr 3+ غیر سمی با استفاده از باکتری های مقاوم به کروم، گزینه ای مقرون به صرفه می باشد. در این تحقیق، یک ژن کدکننده کرومات ردوکتاز به نام YieF از ژنوم E.coli با استفاده از PCR تکثیر شد. سپس محصول PCR در وکتور pCDFduet تحت پروموتر T7 همسانه سازی شد و به باکتری میزبان Rosetta (DE3) منتقل شد. سویه حاصل R-YieF نامگذاری شد. القائ باکتری با IPTG منجر به تولید YieF به صورت یک پروتئین همراه با شریک الحاقی His.tag شد. بررسی حلالیت پروتئین نشان داد که مقدار قابل توجهی از پروتئین در فاز محلول پروتئین یافت می شود. مقایسه ی منحنی رشد و تعیین مقدار Cr 6 + حذف شده در محیط R-YieF و سویه شاهد نشان داد که بیش بیان YieF اثر قابل توجهی بر تجمع Cr 6 + دارد. علاوه بر این در این تحقیق ژن کد کننده یکی از ایزوفرم های برنج به نام OsMT1 که قبلا در وکتور pET41a همسانه سازی شده بود و قابلیت جذب Cr 6+ را داشت به طور همزمان با YieF بیان شد (Co-expression). بدین منظور دستواره pET41a-OsMT1 در سویه R-YieF ترانسفورم شد و سویه R-MT-YieF ساخته شد. استخراج پروتئین از این سویه و ران بر روی ژل SDS-PAGE بیان همزمان دو پروتئین YieF و OsMT1 را تایید می کرد. در نهایت منحنی رشد سویه های R-MT1، R-YieF، R-YieF-MT1 و سویه شاهد در مقایسه با سویه ها در محیط کشت در حضور 2 میلی مولار Cr 6+ + مقایسه شد. نتایج نشان می دهد که OD پس از 12 ساعت در تمام سه گونه تراریخته بیشتر از شاهد بود. تجمع Cr 6 + در سویه های جدید و همچنین کنترل در طول 0، 2، 6 و 10 ساعت بعد از افزودن IPTG و Cr 6 + تعیین شد. نتایج نشان داد که انباشت Cr 6+ در سویه های تراریخته بیشتر از سویه شاهد می باشد. به طوریکه بعد از 12 ساعت مقدار انباشت Cr 6+ 10، 7، 98/4 و 9/ 2به ترتیب در سویه های R-YieF-MT، R-YieF، R-MT1 و سویه شاهد بود که نشان دهنده اثر قابل ملاحظه بیان همزمان OsMT1و YieF در حذف Cr 6 + است. ایزوترم جذب نشان داد که مقدار تجمع Cr 6+ در سویه R-MT1-YieF وابسته به غلظت اولیه Cr 6 + می باشد. با این حال جذب ثابت باقی ماند زمانی که غلظت اولیه به 3 میلی مولار رسید. واژگان کلیدی : فلزات سنگین، کروم، متالوتیونین، کرومات ردوکتاز، بیان پروتئین

ارتقاء امنیت وب با وف بومی