SUPERVISOR
محمدآقا مرشد (استاد مشاور) شهناز رضوي دليگاني (استاد راهنما) سعيد کرباسي (استاد مشاور) محمدعلي گلعذار (استاد راهنما)
STUDENT
Sedigheh Vaezifar
صديقه واعظي فر
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده مهندسی مواد
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1387
TITLE
Design and fabrication of nanocomposite scaffold of PLGA/Chitosan and evaluating differentiation potential of mesenchymal stem cell on scaffold for nerve tissue engineering
In this study, nano-biocomposites composed of poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) and chitosan (CS) were electrospun using two different fabrication methods. In the single nozzle method, the CS nano-powders dispersed in PLGA solutions were electrospun through a single nozzle. In the double-nozzle method, PLGA and CS solutions were simultaneously electrospun from two different syringes and the electrospun PLGA nanofiber and electrosprayed CS nanoparticles were mixed and collected on the rotating drum to prepare the nano-biocomposite membrane. The PLGA/CS scaffolds were prepared at the different ratios of 90/10, 80/20, and 70/30 (w/w) %. In both methods were produced successfully randomly-oriented and aligned PLGA and PLGA/CS nanofibrous scaffolds. However, the single-nozzle method was associated with decreasing average fiber diameter of PLGA/CS nano-biocomposites when the CS content was increased. Moreover, the biocomposites fabricated by this method exhibited improved mechanical and hydrophilic properties in the evaluation of the scaffolds produced. The differentiation of human adipose derived stem cells (h-ADSCs) on artificial scaffolds is a critical issue in regeneration medicine. The Schwann cells (SCs) may be obtained from nerve biopsies for autologous tralantation. However, it is difficult to obtain sufficient amount of SCs for clinical applications. H-ADSCs can be induced to differentiate into Schwann-like cells (S-like cells) and used for autologous tralantation. In this study, tissue-engineered scaffold with chitosan nano-powders (CS) and poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) was investigated for its ability in the peripheral nerve regeneration in-vitro. The differentiation of h-ADSCs on PLGA/CS scaffolds produced Schwann cells. Six groups were compared for generating Schwann cells from ADSCs by considering the expression of several Schwann cell markers (GFAP, MBP and S100) using immunocytochemistry after differentiation. Schwann cell viability and morphology were investigated by the MTT assay and SEM micrographs. Moreover, the nano-chitosan promoted the formation of Schwann cells. However, the align orientation of nanofibers in scaffolds guided the differentiation of ADSCs towards Schwann cells in the constructs. Therefore, the combination of nano-chitosan and fiber alignment in PLGA/CS scaffolds can be promising in peripheral nerve regeneration.
چکيده در سال‌هاي اخير با گسترش علم بين رشته‌اي مهندسي بافت که تلفيقي از به‌کارگيري روش‌هاي سلولي، مهندسي و علم مواد در ساخت بافت‌هاي زنده است، روزنه‌ي اميدي براي درمان و ترميم ضايعات بافتي و نقص عضو پديد آمده است. با استفاده از اين فناوري، سلول‌هاي ناحيه‌اي از بدن يا سلول‌هاي بنيادي را در محيط خارج بدن کشت داده و سپس مجتمع سلولي رشد کرده و يا تمايزيافته را وارد بدن فرد بيمار مي‌کنند. در بيشتر مواقع، تکثير و تمايز سلول‌ها بر روي بسترهايي صورت مي‌گيرد که تقليدي از ماتريکس خارج سلولي سلول‌هاي حيواني است. اين بسترهاي مهندسي بافت از جنس پليمرهاي مصنوعي و طبيعي مي‌باشند. پلي‌لاکتيک‌گليکوليک‌اسيد (PLGA) و کيتوزان به‌ترتيب از دسته‌ي پليمرهاي مصنوعي و طبيعي متداول براي کاربردهاي مهندسي بافت هستند. در اين پژوهش با استفاده از دو روش، داربست مهندسي بافت نانوبيوکامپوزيتي PLGA/CS تهيه شد. در روش اول نانوذرات کيتوزان تهيه‌شده به روش ژل‌شدن يوني در محلول پليمري PLGA به‌صورت يکنواخت توزيع شده و به‌روش الکتروريسي تک مرحله‌اي با استفاده از يک سرنگ ريسيده شد. در روش دوم تهيه‌ي نانوذرات کيتوزان از محلول کيتوزان به‌روش الکترواسپري بهينه‌سازي شد و با استفاده از دو سرنگ به‌طور همزمان اين نانوبيوکامپوزيت تهيه شد. در اين روش، الکترواسپري نانوذرات کيتوزان بر روي نانوالياف PLGA در حال جمع‌آوري بر روي درام به‌طور همزمان، نانوبيوکامپوزيتي يکنواخت حاصل شد. اين داربست‌ها با سه نسبت مختلف LGA/CS 30/70، 20/80 و 10/90 به هر دو روش با موفقيت ساخته شد. در همه نسبت‌هاي ذکرشده و به هر دو روش، اليافي با آرايش تصادفي و هم‌راستا تهيه شد و مشخصه‌هاي فيزيکي- شيميايي داربست‌هاي تهيه‌شده به روش‌هاي مختلف ارزيابي شد. روش‌هاي مورد استفاده در مشخصه‌يابي داربست عبارت‌اند از: مشاهده مورفولوژي الياف توسط ميکروسکوپ الکتروني روبشي (SEM) و همچنين ميکروسکوپ الکتروني عبوري (TEM)، تعيين ميزان جذب بافر فسفات () تحت عنوان نسبت تورم، تعيين زاويه‌ي تماس آب با سطح داربست، اندازه‌گيري خواص مکانيکي، زيست تخريب‌پذيري داربست در محيط بيولوژيکي خارج از بدن، طيف‌سنجي مادون قرمز (FTIR)، اسپکتروسکوپي فوتوالکتروني اشعه ايکس (XPS) و مطالعه‌ي خواص حرارتي داربست. نتايج حاصل شده در اين بخش نشان داد در حالت بهينه، کمترين ميانگين قطر الياف در روش تک سرنگي و در داربست PLGA/CS با نسبت 30/70، معادل nm 286 در الياف با آرايش هم‌راستا به‌دست آمد. درصد تورم اين داربست به‌عنوان معياري از آبدوستي برابر 10/11 ± 57/305 درصد و ميزان تخريب نمونه در محيط بيولوژيک خارج از بدن در مدت يک ماه 35-30 درصد حاصل شد. استحکام کششي، مدول يانگ و درصد ازدياد طول به‌ترتيب برابر 19/1 ± 40/13 و 29/0 ± 00/3 مگاپاسکال و 8/1 ± 0/36 درصد براي اين داربست به‌دست آمد. در بخش سلولي، پس از استخراج سلول‌هاي بنيادي از بافت چربي، اين سلول‌ها جهت ارزيابي تمايزشان به سلول شوان استفاده شد. پس از ارزيابي سازگاري زيستي اين سلول‌ها با داربست‌هاي تهيه‌شده، در ادامه تمايز سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي به سلول‌هاي شوان بر روي داربست‌ها با خواص بهينه مطالعه شد. سپس اثر پارامترهاي مختلف بر رشد و تکثير و تمايز سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي بررسي شد. پس از بهينه‌سازي نهايي خواص داربست و رشد و تکثير و تمايز سلول‌ها بر روي آن، تمايز سلول‌هاي بنيادي به سلول‌هاي شوان از نظر ايمونوسايتوشيمي اثبات شد و اين محصول به‌عنوان فرآورده‌ي مهندسي بافت بهينه جهت ترميم ضايعات اعصاب محيطي معرفي شد. روش‌هاي مورد استفاده در اين بخش شامل بررسي ميزان چسبندگي سلول‌ها به داربست، ارزيابي ميزان بقاء سلول‌ها و تکثير سلولي از طريق روش MTT و ارزيابي ميزان سلول‌هاي تمايزيافته است. جهت بررسي درصد سلول‌هاي تمايزيافته به سلول‌هاي شوان از روش رنگ‌آميزي ايمونوفلورسنت مارکرهايGFAP، MBP، S100 استفاده شد و نتايج نشان داد بيشترين درصد بيان مارکرهاي اختصاصي ذکرشده در داربست PLGA/CS تهيه‌شده به روش تک سرنگي با نسبت 30/70 با آرايش الياف هم‌راستا به‌ترتيب برابر 5/89، 7/85 و 1/96 درصد حاصل شد. هر مرحله از آزمايش‌ها سه بار تکرار شد و آناليز آماري داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار -17 و تجزيه و تحليل يافته‌ها با استفاده از روش ANOVA One Way انجام شد. اين نتايج نشان داد که داربست‌هاي PLGA/CS با آرايش الياف هم‌راستا قابليت کاربرد وسيع جهت ترميم و بازسازي اعصاب محيطي دارند.