ردیابی و شناسایی مولکولی ویروس های مهم ارکیده در استان های اصفهان و تهران

STUDENT

DEGREE

YEAR

Orchids belonging to Orchidaceae , are the biggest and the most divers plant family in size, shape and color of flowers. All over the world, orchid cutting flowers and potting plants are popular because of their beautiful appearance, glorious inflorescence, wide color type and long-lasting. Among the orchids, Cymbidium sp., Dendrobium sp., Phalaenopsis sp., Cattleya sp., Oncidium sp., Paphiopedilum sp. and Vanda sp. are the most commercially important genera. Of the 30 orchid viruses, Cymbidium mosaic virus (CymMV), Odontoglossum ringspot virus (ORSV), Cymbidium ringspot virus (CymRSV), Orchid fleck virus (OFV) and Dendrobium mosaic virus (DeMV) are the most important viruses. Since, there is no report for orchid viruses in Iran, 190 orchid samples including symptomless samples and samples showing mild mosaic and chlorotic regions were collected from greenhouses in Isfahan and Tehran provinces in 2014-2015. After total RNA extraction, RT-PCR using specific primers were performed for detecting of CymMV, ORSV, CymRSV, OFV and DeMV. The expected bands were amplified in PCR reactions with specific primers of CymMV (CymMV-CP-F1/R1) and ORSV (ORSV2011 F/R). No amplification with CymRSV, OFV and DeMV specific primers was visualised in the PCR reactions. The replicons were sequenced and analyzed using BLAST program. BLAST analysis revealed high homology of these sequences with CymMV and ORSV sequences available at GenBank. For comparison of coat protein gene of CymMV and ORSV Iranian isolates and those of other isolates available at GenBank, specific primer pair amplifying full length of coat protein gene was designed for CymMV (CyMV 1F165/1R2, 1047bp) using FastPCR 6.5 software. Primer pair ORSV2011 F/R was used for amplification of full length of ORSV coat protein gene. The RT-PCR was performed and expected bands were amplified. Five CymMV isolates and six ORSV isolates representing different hosts, symptoms and geographical regions were sequenced. Multiple alignments of coat protein gene nucleotide sequence of CymMV and ORSV Iranian isolates with those of other isolates was done using DNAMAN 4.02 software. The comparisons showed 88.2%-98.8% and 96.9%-99.6% homology for CymMV isolates and 93.7%-100% and 94.9%-100% homology for ORSV isolates in nucleotide and amino acid levels, respectively. The high rate of sequence homology of coat protein gene among CymMV and ORSV different isolates indicates low genetic diversity and high conservation of this region. In phylogenetic tree analysis of nucleotide sequence of coat protein gene, CymMV Iranian isolates and GenBank isolates formed two groups A and B. Iranian isolates included in group A. There were no clusters based on geographical regions, symptoms or host plants. No similar clustering was seen in amino acid level. Phylogenetic tree analysis of the ORSV Iranian isolate and GenBank isolates did not show any grouping based on different hosts, symptoms or geographical regions. Due to high rate of mixed infection in collected samples to simultaneous detection of CymMV and ORSV, duplex RT-PCR method was done using CymMV-CP-F1/R1 and ORSV2011 F/R primer pairs successfully after optimization of RT-PCR. In mechanical inoculation CymMV and ORSV cause cholorotic local lesions on Datura stramonium and Nicotiana tabacum cv. Xanthi after four weeks, respectively. Test plants infection was confirmed with RT-PCR method. To the best of our knowledge, this is the first report of CymMV and ORSV in Iran. Key words: Orchids, Cymbidium mosaic virus , Odontoglossum ringspot virus and Genetic variation

گیاهان ارکیده به خانواده Orchidaceae تعلق دارند که یکی از بزرگ ترین و متنوع ترین خانواده های گیاهی از لحاظ اندازه، شکل و رنگ گل است. در سرتاسر جهان، گل های شاخه بریده و محصولات گلدانی ارکیده ها به واسطه ظاهر زیبا، گل آذین با شکوه، تنوع گسترده رنگ و ماندگاری طولانی مدت، شهرت زیادی پیدا کرده اند. در بین جنس های مختلف ارکیده برخی از جنس ها همانند Cymbidium sp.، Dendrobium sp.، Phalaenopsis sp.، Cattleya sp.، Oncidium sp.، Paphiopedilum sp. و Vanda sp. اهمیت اقتصادی بیشتری دارند. تا کنون بیش از 30 ویروس از ارکیده گزارش شده است که از بین آنها ویروس موزاییک سیمبیدیوم Cymbidium mosaic virus (CymMV)، ویروس لکه حلقوی ادونتوگلاسوم، Odontoglossum ringspot virus (ORSV)، ویروس لکه حلقوی سیمبیدیوم Cymbidium ringspot virus (CymRSV)، ویروس لکه ریز ارکیده Orchid fleck virus (OFV) و ویروس موزاییک دندروبیوم Dendrobium mosaic virus (DeMV) از اهمیت بیشتری برخودار هستند. با توجه به این که تاکنون گزارشی از این ویروس ها از گلخانه های پرورش ارکیده ایران صورت نگرفته است، به منظور ردیابی ویروس های ارکیده از گلخانه های این گل در استان های اصفهان و تهران تعداد 190 نمونه با علایم ویروسی شامل موزاییک خفیف و نواحی رنگ پریده به همراه نمونه های بدون علایم جمع آوری شدند. پس از استخراج آر. اِن. اِی کل، با استفاده از تکنیک RT-PCR و جفت آغازگرهای اختصاصی گونه و اختصاصی مربوط به جنس ویروسی، به ردیابی ویروس موزاییک سیمبیدیوم، ویروس لکه حلقوی ادونتوگلاسوم، ویروس لکه حلقوی سیمبیدیوم، ویروس لکه ریز ارکیده و ویروس موزاییک دندروبیوم در نمونه های جمع آوری شده اقدام گردید. در روش RT-PCR فقط در واکنش هایی که از جفت آغازگرهای اختصاصی ویروس های CymMV(CymMV-CP-F1/R1) و ORSV(ORSV2011 F/R) استفاده شد، به ترتیب باندهای مورد نظر bp669 و bp527 تکثیر گردیدند و در سایر واکنش ها هیچ گونه باندی تکثیر نشد. باندهای تکثیر شده توالی یابی شدند و با استفاده از نرم افزار BLAST مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی توالی ها با استفاده از نرم افزار BLAST نشان دهنده شباهت بالای آن ها با توالی ویروس های CymMV و ORSV موجود در بانک ژن بود. میزان آلودگی نمونه های جمع آوری شده به CymMV 38%، ORSV 45% و همچنین آلودگی همزمان دو ویروس 27% برآورد شد. به منظور مقایسه توالی ژن پروتیین پوششی جدایه های ایرانی ویروس های CymMV و ORSV با جدایه های موجود در بانک ژن، جفت آغازگر CyMV 1F165/1R2 (باند bp1047) به منظور تکثیر ژن تمام طول پروتیین پوششی CymMV طراحی شد، همچنین از جفت آغازگر اختصاصی (ORSV2011 F/R) به منظور تکثیر تمام طول پروتیین پوششی ORSV استفاده شد. قطعات مورد نظر تکثیر شده در پنج جدایه از CymMV و شش جدایه از ORSV که از نظر علایم، میزبان و منطقه متفاوت بودند، به صورت مستقیم تعیین توالی شدند. همردیف سازی چند تایی توالی پروتیین پوششی جدایه های ایرانی ویروس های CymMV و ORSV با جدایه هایی موجود در بانک ژن با استفاده از نرم افزار DNAMAN 4.02 نشان دهنده میزان تشابه 8/98%-2/88% و 6/99%-9/96% در سطح نوکلئوتیدی و 100%-7/93% و 100%-9/94% در سطح آمینواسیدی، به ترتیب در CymMV و ORSV بود. سطح بالای تشابه پروتیین پوششی جدایه های ایرانی با سایر جدایه ها نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین و حفاظت شدگی این ناحیه از ژنوم دو ویروس می باشد. با ترسیم درخت تبارزایی به روش Neighbor joining در سطح نوکلئوتیدی، جدایه های ویروس CymMV به دو زیر گروه A و B تقسیم بندی شدند و جدایه های ایرانی این ویروس در زیر گروه A قرار گرفتند، با این حال این سطح از گروه بندی نتوانست جدایه ها را از لحاظ موقعیت جغرافیایی و میزبانی از یکدیگر تفکیک کند. چنین گروه بندی در سطح آمینواسیدی مشاهده نشد. دردرخت تبارزایی رسم شده به روش Neighbor joining در سطح نوکلئوتیدی در مورد ویروس ORSV گروه بندی مشخصی بین جدایه های ایرانی ORSV با سایر جدایه های بانک ژن دیده نشد. با توجه به بالا بودن میزان آلودگی مخلوط به ویروس های CymMV و ORSV در نمونه های جمع آوری شده، به منظور شناسایی همزمان این دو ویروس، واکنش duplex RT-PCR با بهینه سازی شرایط و با استفاده از جفت آغازگرهای CymMV-CP-F1/R1 (باند bp669) و ORSV2011 F/R (باند bp527)، با موفقیت انجام شد. در آزمون انتقال مکانیکی ویروس های CymMV و ORSV به ترتیب در گیاهان محک Datura stramonium و Nicotiana tabacum cv. Xanthi پس از چهار هفته تولید لکه های موضعی کلروتیک کردند. آلودگی این گیاهان توسط RT-PCR تایید شد. با توجه به اطلاعات موجود، این اولین گزارش از وجود ویروس های CymMV و ORSV در ایران می باشد. کلمات کلیدی: ارکیده، ویروس موزاییک سیمبیدوم، ویروس لکه حلقوی ادونتوگلاسوم، تنوع ژنتیکی.