ردیابی و شناسایی مولکولی توسپوویروس‌های آلوده کننده‌ی سبزیجات در منطقه مرکزی ایران

STUDENT

DEGREE

YEAR

In Solanaceae family the important plants such as potato, tomato and pepper are affected by many viruses including tospoviruses. Several viruses in Tospovirus genus cause severe losses in agronomic and horticultural crops and ornamental plants production. Tomato spotted wilt virus (TSWV), Impatiens necrotic spot virus (INSV) and Tomato yellow ring virus (TYRV) are the most important viruses in the Tospovirus genus. Since economic importance of TSWV, TYRV and INSV and lack of information about the status of their incidence in central region of Iran, during 2014-2015 tomato, potato pepper and alstroemeria samples showing chlorotic and necrotic rings, wilting and stunting symptoms were collected. Total RNA was extracted using lithium chloride and was subjected to RT-PCR using the specific primer pair of Tospovirus genus (gl3637/gl4435). The expected band of 810 bp was amplified in some samples. To detect TSWV, INSV and TYRV, specifically, these samples were tested by RT-PCR with primer pairs TSWV.2/TSWV.1(628bp), S1976/S2847 (870bp), S1983-for/S2676-rev (780bp) and FJJ200274/ FJJ200275 (810bp) to detect TSWV, INSV-F3/INSV-R (763bp) and INSV-N5/INSV-N3 (981bp) to detect INSV and N1/N2 (810bp) to detect TYRV. The replicons were sequenced and BLAST search showed high homology of sequenced isolates with TSWV and TYRV sequences available at GenBank. Out of 277 samples, 10 samples including 3 pepper samples, 4 tomato samples and 3 potato samples amplified expected band of TSWV and 24 tomato samples and 22 alestroemeria samples amplified expected band of TYRV. During this study, INSV was not detected in collected samples. For determining genetic variation of TSWV and TYRV Iranian isolates, full length of nucleocapsid gene of six TSWV and four TYRV samples representing different locations and hosts were cloned in pJET1.2/blunt plasmid and sequenced. Multiple alignment of nucleotide and amino acid sequences of nucleocapsid gene of TSWV and TYRV was done using CLC Sequence Viewer 7.5 and DNAMAN 4.0 softwares. Multiple alignment revealed high average homology of 99.35% and 99.30% among Iranian isolates of TSWV and TYRV, respectively. In addition, high average homology of 98/64 and 96.21% was found between Iranian isolates of TSWV and TYRV and other isolates available at GenBank, respectively. Phylogenetic tree was drawn based on amino acid sequence of nucleocapsid gene of TSWV and TYRV Iranian isolates and those of isolates available at GenBank with Neighbor joining method by DNAMAN 4.0 software. In phylogenetic analysis existence of three groups were demonstrated for TSWV isolates. All Iranian isolates of TSWV including this study isolates and two isolate available at GenBank with accession numbers (KT899947) and (KT899948) formed group II. Two isolates from South Africa with accession numbers (AJ296600) and (CA01284) formed group I and other isolates from Asia, Europe and USA formed Group III. In phylogenetic tree, TYRV Iranian isolates were separated from TYRV Polish isolates with accession numbers (KR139964), (KR139961) and (KR139958) by forming group II and III including strains s and strains t, respectively. All isolates from Isfahan and Chaharmahal-O-Bakhtiari provinces were found as strain t. Phylogenetic analysis of TSWV and TYRV isolates revealed that there is no correlation between clustering and different geographical regions or host plants. However, TYRV isolates separated based on strain type in phylogenetic analysis. Keywords : Tomato spotted wilt virus , Tomato yellow ring virus , Impatiens necrotic spot virus , Genetic variation

درگیاهان خانواده Solanaceae تعدادی از محصولات مهم کشاورزی از جمله سیب زمینی، گوجه فرنگی و فلفل تحت تاثیر عوامل بیماری‌زای ویروسی زیادی قرار می‌گیرند، که ویروس های جنس Tospovirus از آن جمله اند. گونه های متعدد این جنس ویروسی، خسارت زیادی را به محصولات زراعی، باغی و زینتی وارد می‌سازند که از مهمترین آنها می توان به ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه‌فرنگی ( Tomato spotted wilt virus, TSWV)، ویروس لکه نکروتیک گل حنا ( Impatiens necrotic spot virus, INSV) و ویروس حلقه زرد گوجه‌فرنگی ( Tomato yellow ring virus, TYRV) اشاره نمود. با توجه به اهمیت اقتصادی زیاد این سه ویروس‌ و کمبود اطلاعات در مورد وضعیت گسترش آن‌ها در منطقه مرکزی ایران، ضروری بود مطالعاتی در مورد پراکنش و دامنه میزبانی آنها در این منطقه صورت گیرد. بدین منظور، طی سال‌های 1394-1393 از گلخانه‌ها و مزارع کشت گوجه‌فرنگی، سیب‌زمینی و همچنین گیاه زینتی آلسترومریا با علائم توصیف شده برای توسپوویروس‌ها، نمونه‌برداری گردید. از نمونه‌های مزبور به روش لیتیوم کلراید RNA کل استخراج شد. در ارزیابی امکان آلوده بودن نمونه‌ها به ویروس های جنس توسپوویروس، RNA کل هر نمونه با جفت آغازگر اختصاصی جنس تاسپوویروس (gl3637/gl4435) تحت واکنش RT-PCR قرار گرفت و نمونه‌هایی که الگوی باندی مورد انتظار (bp810( را تکثیر کردند، جهت بررسی‌های دقیق تر انتخاب شدند. نمونه‌های انتخابی با جفت آغازگرهای اختصاصی TSWV.2/TSWV.1 (bp628(، S1976/S2847 (bp870)، S1983-for/S2676-rev (bp780) و FJJ200274/ FJJ200275 (bp810) جهت ردیابی TSWV، INSV-F3/ INSV-R2 (bp763) و INSV-N5/ INSV-N3 (bp981) جهت ردیابی INSV و N1/N2 (bp805) جهت ردیابی TYRV، در واکنش RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفتند. محصول PCR تکثیر شده تعدادی از نمونه ها تعیین ترادف نوکلئوتیدی گردید و با نرم افزار BLAST بررسی شد، که بر اساس نتایج بدست آمده حضور دو ویروس TSWV و TYRV در مزارع و گلخانه های منطقه تایید شد. در مجموع، از 277 نمونه جمع آوری شده در استان اصفهان و چهار محال و بختیاری، 10 نمونه TSWV ( سه جدایه از فلفل، سه جدایه از سیب زمینی و چهار جدایه از گوجه فرنگی) و46 نمونه TYRV (22 جدایه از گوجه فرنگی و 24 جدایه از آلسترومریا) شناسایی شدند. در طی این بررسی هیچ نمونه‌ی آلوده به INSV ردیابی نگردید. به منظور انجام مقایسات مولکولی جدایه های دو گونه‌ی TSWV و TYRV، ژن کامل نوکلئوکپسید تعدادی از نمونه‌های آلوده و متفاوت به لحاظ میزبانی و جغرافیایی، تکثیر، همسانه سازی و تعیین ترادف شدند. نتایج همردیف سازی چند تایی توالی ها بااستفاده از نرم افزار CLC Sequence Viewer 7.5 و ترسیم ماتریس تشابه با استفاده از نرم افزارDNAMAN 4.0 نشان داد که جدایه‌هایTSWV و TYRV اصفهان و چهار محال و بختیاری در هر دو سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی شباهت زیادی در داخل خود دارند، به طوری که بین جدایه‌های TSWV میانگین تشابه 35/99% و بین جدایه‌های TYRV میانگین تشابه 30/99 مشاهده شد. همردیف سازی چند تایی توالی آمینواسیدی ژن نوکلئوکپسید جدایه‌های مورد بررسی TSWV در این پژوهش با برخی از جدایه‌های موجود در بانک ژن نیزشباهت بالایی(64/98%) را نشان داد. بر اساس ترسیم درخت تبارزایی به روش Neighbor-joining با استفاده از نرم افزارDNAMAN 4.0 ، همه جدایه‌های ایرانی TSWV شامل جدایه های این تحقیق و دو جدایه موجود در بانک ژن با شماره های دسترسی (KT899947) و (KT899948) در گروه II قرار گرفتند. دو جدایه‌ از آفریقای جنوبی با شماره های دسترسی (AJ296600) و (CAC01284) در گروه I و جدایه هایی از آمریکا، اروپا و آسیا درگروه III قرار گرفتند. همردیف سازی چند تایی بین جدایه‌های TYRV اصفهان و چهارمحال و بختیاری و جدایه‌های موجود در بانک ژن نیز درجات بالایی از تشابه (21/96%) را نشان داد. بر اساس درخت تبار زایی رسم شده به روش Neighbor-joining با استفاده از نرم افزارDNAMAN 4.0، همه جدایه‌های ایرانی در گروه II (استرین‌های s ) و گروه III (استرین‌هایt ) قرار گرفتند و از گروه جدایه‌های لهستانی ( گروه I) با شماره های دسترسی (KR139964)، (KR139961)و (KR139958) متفاوت بودند. تمامی جدایه‌های TYRV اصفهان و چهار محال و بختیاری مورد مطالعه در این پژوهش با درصد بالایی از تشابه (100-6/99%) در گروه استرین‌های t قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل درخت تبارزایی در مورد جدایه‌های مختلف TSWV و TYRV آشکار کرد که هیچگونه ارتباطی بین گروه‌بندی‌ها و منطقه جغرافیایی و گیاهان میزبان وجود ندارد. همچنین مشخص شد که جدایه‌های TYRV بر اساس نوع استرین (s یا t) از یکدیگر جدا می‌شوند. کلمات کلیدی: ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه فرنگی، ویروس حلقه زرد گوجه فرنگی، ویروس لکه مرده گل حنا، نوکلئوکپسید، تنوع ژنتیکی