SUPERVISOR
Masoud Bahar,Bahram Sharifnabi
مسعود بهار (استاد راهنما) بهرام شریف نبی (استاد مشاور)
STUDENT
Mohammad Ghobadi alami
محمد قبادی علمی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1391
TITLE
Detection of Bacterial Causal Agents of Bean Leaf Blight in Lorestan, Markazi and Hamedan Provinces
Bean (Phaseolus vulgaris L.) with regard to large caloric intake and protein contents ranks next in importance to cereals and potato. The major bacterial diseases including common bacterial blight ( Xanthomonasaxonopodis pv. phaseoli ), halo blight ( Pseudomonassavastonoi pv. phaseolicola ), and bacterial wilt ( Curtobacteriumflaccumfaciens pv. flaccufmaciens ) are three commonly occurring bean diseases worldwide which have the potential to causesignificantyield losses through foliage blight and wilting disorders.In recent years, rapidly spreadingoutbreaks of foliage blight and wilting has been developed in bean fields of Iran, although their causative agents have not been clearly determined. To investigate the causal pathogens of bean blight and wilting, a survey was conducted in bean fields of Lorestan, Hamedan and Markazi provinces during 2013-2014. Of the samples collected from commercial fields located in these regions, total of 57 bacterial isolates were recovered on general and semiselective media. According to their morphological, serological and molecular characteristics, the isolates were categorized into three distinct groups. The Bacterial strains in group I were Gram-negative with translucent yellow colonies which are identified as Xanthomonasaxonopodis pv. phaseoli (Xap) based on biochemical and serological properties. The isolates also produced a 730bp DNA fragment in PCR reaction using specific primer pair (X4c-F / X4e-R) for Xap. The bacterial strains in group I was not able to diffuse melanin pigment in the culture and failed to amplify a DNA fragment with specific primer pair (Xf1/Xf2) for Xanthomonasfuscans su. fuscans, confirming the identification of strains group I as Xap. The Gram-positive bacterial representatives in group II formed creamy yellow colonies on Nutrient Agar medium and produced a 306 bp DNA band in PCR reaction using specific primer pair (Cff-For2 / Cff-Rev4 ) for Curtobacteriumflaccumfaciens pv. flaccufmaciens (Cff). The biochemical test also support the findings that the isolates group II belonged to Cff. The most isolates of Cff were appeared yellowish (carotenoid pigments )and pink on Nutrient Broth Yeast (NBY) medium All the strains Partial amplification and sequence analysis of the 16S rDNA of this isolate with primer Ps-For / Ps-Rev also revealed that the strain is identical to P. viridiflava . After confirming the presence of Cff and Xap as the main causal agents of bean foliage blight and wilting, a multiplex PCR was performed using X4c-F / X4e-R and Cff primers for the simultaneous detection of Xap and Cff bacteria in the infected leaf and seed materials. In all the samples subjected to multiplex assay, a 306 bp band specific for Cff observed along with a 730bp band specific for Xap. The data obtained in the present study reveals the occurrence of both foliage blight and wilting diseases in bean fields of Lorestan, Hamedan and Markazi provinces caused by Xap and Cff respectively. Since both of the pathogens are transmitted by seed lots, multiplex PCR assay could be a reliable and sensitive method for determining whether or not seeds are infected with these pathogens. Key words : Bean, Xanthomonasaxonopodis pv. phaseoli , Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccufmaciens, Pseudomonas viridiflava, Mutiplex PCR
لوبیا به دلیل داشتن مقادیر بالای پروتیئن و انرژی، بعد از غلات و سیب زمینی از مهمترین محصولات کشاورزی به حساب می آید. بیماری های باکتریایی نظیر سوختگی معمولی لوبیا Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli ))،سوختگی هاله دار لوبیا ( Pseudomonas savastonoi pv. phaseolicola ) و پژمردگی باکتریایی لوبیا ( Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccufmaciens ) از عوامل محدود کننده تولید این محصول در بسیاری از مناطق کشت لوبیا در دنیا می باشند. در سالهای اخیر، بیماریهای لکه برگی و پژمردگی در مزارع لوبیای استان های لرستان و مرکزی، خسارات زیادی را به این محصول وارد کرده است که به ظن باکتریایی بودن، تشخیص عوامل ایجاد کننده این بیماری ها ضروری بود. جهت تعیین عوامل بیمارگر باکتریایی احتمالی در این مزارع، از گیاهان لوبیای واجد علایم لکه برگی و پژمردگی درمزارع مختلف استانهای مزبور نمونه برداری شد. از کشت نمونه های مزبور در محیط های کشت عمومی و اختصاصی57 جدایه باکتریایی به دست آمد. جدایه های مزبور با توجه به خصوصیات مورفولوژیکی، سرولوژیکی و مولکولی در سه گروه قرار متفاوت گرفتند. جدایه های باکتریایی گروه I گرم منفی بوده وکلنی های زرد شفاف مایل به لیمویی داشتند که بر اساس خصوصیات بیماری زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap)تشخیص داده شدند. این جدایه ها با جفت آغازگر اختصاصی X4c-F/X4e-Rدر واکنش PCRیک باندbp730 مربوط به Xap را تکثیر نمودند. به دلیل ناتوانی در تولید رنگدانه ملانین در محیط کشت و نیز عدم تکثیر باند bp450 با جفت آغازگر اختصاصی Xf1/Xf2، هیچ کدام از این جدایه ها Xanthomonas fuscans su. fuscans ، تشخیص داده نشدند. جدایه های باکتریایی گروه II گرم مثبت بوده و روی محیط آگار غذایی (NA) کلنی های زرد مایل به کرم و یا صورتی داشتند. با انجام آزمون- های بیماری زایی و بیوشیمیایی جدایه های گروهII، تعلق این جدایه ها به باکتری(Cff) Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccufmaciens عامل پژمردگی باکتریایی لوبیا معلوم گردید. همچنین، این جدایه ها در واکنش PCR با جفت آغازگر اختصاصیCff-For2/Cff-Rev4، یک باند bp306 تکثیر نمودند. توالی یابی نوکلئوتیدی این باند و همردیف سازی آن با توالی های موجود در بانک ژن، شباهت 97 درصدی توالی این جدایه ها با جدایه های Cff موجود بانک ژن را مشخص کرد.جدایه های Cff به دست آمده در این بررسی روی محیط NBYکلنی های زرد و صورتی کاروتنوئیدی داشتند. جدایه های باکتریایی موجود در گروه III به واسطه گرم منفی بودن و تولید ماده فلئورسنت در محیط King’s B از بقیه مجزا شدند. پس از انجام آزمون های مختلف، بیشترین شباهت بیوشیمیایی برای یکی از جدایه ها با باکتری P.viridiflava به دست آمد و سایر جدایه ها نیز که توانایی بیماری زایی در غلاف و بوته لوبیا را نداشتند از دور آزمایشات حذف شدند. پس از تکثیر قسمتی از ناحیه 16S rDNAاین جدایه با جفت آغازگر Ps-For/Ps-Rev و توالی یابی قطعه آن معلوم شد که این جدایه ها به لحاظ ترادف نوکلئوتیدی نیز با جدایه P.viridiflava مشابهت کامل دارد. پس از تایید وجود دو باکتری XapوCff به عنوان عوامل اصلی لکه برگی و پژمردگی در مزارع لوبیای استان های لرستان و مرکزی، به منظور به دست آوردن یک روش سریع، حساس و کم هزینه برای ردیابی همزمان دو باکتری در بذرهای آلوده، از روش Multiplex PCR، با به کارگیری جفت آغازگرهای اختصاصی باکتری های Xap(Xf1/Xf2) و Cff-For2/Cff-Rev4) Cff)، استفاده شد که به ترتیب منجر به تکثیر باندهای bp306 و bp730 گردید. به این ترتیب معلوم شد که Multiplex PCR می تواند یک روش کارآمد، سریع و کم هزینه برای ردیابی همزمان باکتری های Cffو Xap در بذر لوبیای آلوده باشد. کلمات کلیدی : لوبیا، واریانت صورتی، واریانت زرد، حساسیت PCR، Multiplex PCR