تشخیص آلودگی های مخلوط فایتوپلاسمایی در درختان بادام با استفاده از روش های مبتنی بر PCR

STUDENT

DEGREE

YEAR

Almond witches’ broom characterized by proliferated branches , little leaf and general yellowing symptoms is a destructive disease distributed extensively through Isfahan and Chahar Mahal-O- Bakhteiari provinces. Despite the report of Candidatus phytoplasma phoeincium as the causative agent of almond whiches’ broom in Lebanon and Iran, two phytoplasmas Ca . P. phoenicium and Ca . P. aurantifolia have been described as the main etiologic factors of the disease in the central part of Iran. Although each phytoplasma induces damage to its host, the mixed infection may cause synergistic effects on symptom expression. To detect phytoplasmas mixed infection in almond trees, 122 leaf samples from trees showing various symptoms of phytoplasma infection including whiches’ broom, little leaf, yellowing, leaf rolling and vascular necrosis were collected from almond orchards of Isfahan and Chahar Mahal-o- Bakhteiari provinces. After extraction of the whole DNA from the midrib of each leave of the collected samples, the DNAs were processed with P1/P7 or P1/P7A primer pairs in the first run, followed by nested PCR with the R16F2n\\R2 primer pair. From the 122 samples tested, expected fragment of 1239bp was amplified in 87 samples, confirming the presence of phytoplasma in almond trees. RFLP analyses of the amplified fragment by restriction enzymes TaqI، HincII، HpaII، RsaI و HinfI and sequencing of representative samples revealed that the almonds were infected by two distinct phytoplasmas. To determine the level of mixed association of the detected phytoplasmas in the local almonds, species- specific primer pairs were designed for the phytoplasmas detected, based on their 16S rDNA signature sequences. Testing the primers using positive and negative controls, the combinations of AurF1/AurR1 (1156 bp), AurF1/AurR2 (1175 bp), AurF1/AurR3 (1265 bp) and Aur-AlmF/Aur-AlmR (680 bp) were found specific and appropriate for detection of Ca . P. aurantifolia. The primer pairs Pho-F1/R1 (991 bp), Pho-F2/R1 (782 bp), Pho-F1/R2 (1018 bp) and the Pho-F2/R2 (809 bp) proved to be highly specific for Ca . P. phoenicium. For determination of the phytoplasmas mixed association status in almond trees, multiplex nested PCR was performed by simultaneous use of primers AurF1/R2, PhoF2/R2 and Stol12F/R (specific primer for Ca . P. solani- designed by Loh Mousavi) for specific detection of Ca . P. phoenicium ، Ca . P. aurantifolia and Ca. P. solani. Of the 78 phytoplasmas associated samples tested, mixed Ca . P. phoenicium ، Ca . P. aurantifolia and Ca. P. solani association were assessed in three samples. The combination of Ca . P. phoenicium ، Ca . P. aurantifolia was found in 11 cases and 24 mixed Ca . P. aurantifolia and Ca. P. solani were identified in all cases. Ca. P. solani was not found individually or in combination with Ca . P. phoenicium in the samples, suggesting that contrary to its commonness in almonds, Ca. P. solani could not be the important agent to cause almond whiches’ broom disease. Based on the results, it can be concluded that both Ca . P. phoenicium and Ca . P. aurantifolia are the dominant phytoplasmas associated with almond whiches’ broom disease in central part of Iran and Ca . P. solani may have a secondary role in symptoms development . Considering to the prevalence of Ca . P. phoenicium, Ca . P. aurantifolia and Ca. P. solani in the almond orchards, no significant correlation was found among the incidence rates of the occurring phytoplasmas, their symptoms and geographical distribution. In this work, Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) methodology was performed for fast and specific detection of Ca . P. phoenicium and Ca . P. aurantifolia in almond trees. The results provide evidence that this method can be reliably used for diagnosis of the phytoplasmas associated with almond. Keywords : Almond witches broom, Almond phytoplasmas, Primer Designing, Mixed infection

جاروی جادوگر بادام با علایم جارویی شدن، ریز برگی و زردی عمومی یک بیماری مخرب در درختان بادام است که در استان های اصفهان و چهار محال و بختیاری انتشار وسیعی دارد. اگرچه فایتوپلاسمای Candidatus Phytoplasma phoenicium به عنوان عامل اصلی بیماری جاروی جادوگر بادام در لبنان و ایران معرفی شده است، ولی به نظر می رسد که دو فایتوپلاسمای Ca. P. phoenicium و Ca . P. aurantifolia در منطقه مرکزی ایران از اهمیت بیشتری برخوردار باشند. با وجودی که هر یک از این گونه های فایتوپلاسمایی قادر به ایجاد خسارت بر روی میزبان خود هستند، همراهی چند فایتوپلاسمای مختلف در تشدید علایم و خسارت بیماری نیز محتمل است. به منظور بررسی آلودگی مخلوط فایتوپلاسمایی در درختان بادام، طی بازدید از باغات بادام کاری استانهای اصفهان ( نجف آباد، همت آباد، تیران و حاجی آباد) و چهارمحال وبختیاری (شهرکرد، سامان، امامیه، چم چنگ، هوره، ایل بیگی، شوراب صغیر و محمودآباد)، 122 نمونه برگی از درختان مشکوک به بیماری های فایتوپلاسمایی با علایم جارویی شدن، ریز برگی، زردی، پیچیدگی برگ ها، خشکیدگی، تجمع برگی در انتهای شاخه ها و قهوه ای شدن محل آوند تهیه شد. پس از استخراج DNA از رگبرگ‌های گیاهان جمع آوری شده، برای ردیابی عوامل فایتوپلاسمایی در نمونه ها از واکنش PCR استفاده گردید. واکنش دور اول PCR با استفاده از جفت آغازگرP1/P7 و P1A/P7A و واکنش Nested-PCR با استفاده از جفت آغازگر R16F2n/R2 انجام شد که در 87 نمونه قطعه 1239 جفت باز مورد انتظار تکثیر یافت. به منظور بررسی امکان وجود تنوع گونه‌ای در فایتوپلاسماهای ردیابی شده مورد مطالعه، آزمون PCR-RFLP به کمک آنزیم های برشی Taq I، Hinc II، Hpa II، Rsa I و Hinf I انجام گردید . با توجه به نتایج توالی یابی، حضور دو فایتوپلاسمای Ca . P. aurantifolia و Ca . P. phoenicium در نمونه های مورد بررسی ثابت شد. برای ردیابی آلودگی همزمان عوامل فایتوپلاسمایی در بین نمونه ها، آغازگرهای اختصاصی از توالی های های شناخته شده دو گونه مزبور فایتوپلاسمایی براساس نواحی ژنی 16-23S rRNA طراحی شد. طی واکنش PCR با نمونه های شاهد مثبت و منفی، در بین جفت آغازگرهای طراحی شده، چهار ترکیبAurF1/AurR1 (1156جفت باز)، AurF1/AurR2(1175جفت باز)، AurF1/AurR3(1265جفت باز) و Aur-AlmF/Aur-AlmR ( 680 جفت باز) برای تکثیر جداگانه گروه Ca . P. aurantifolia و چهار ترکیب Pho-F1/R1( 991جفت باز)، Pho-F2/R1( 782جفت باز)، Pho-F1/ R2( 1018جفت باز) و Pho-F2/R2 ( 809 جفت باز) برای تکثیر Ca . P. phoenicium مناسب بودند. جهت ردیابی فایتوپلاسمای Ca . P. solani در نمونه های جمع آوری شده بادام منطقه، از جفت آغازگر اختصاصی Stol12F/R [طراحی شده توسط سید لوح موسوی- دانشجوی کارشناسی ارشد بیماری های گیاهی- دانشگاه صنعتی اصفهان] استفاده گردید. برای ردیابی توام سه گونه فایتوپلاسمایی مزبور، از ترکیب جفت آغازگری AurF1/R2، PhoF2/R2 و Stol12F/R در واکنش Multiplex-PCR استفاده شد. با استفاده از این روش، در بین 87 نمونه که آلودگی فایتوپلاسمایی آن ها با جفت آغازگر R16F2n/R2 اثبات شده بود، سه نمونه به طور همزمان آلوده به سه فایتوپلاسمای Ca . P. phoenicium، Ca . P. aurantifolia و Ca . P. solani بودند، 11 نمونه، آلودگی توامان با Ca . P. aurantifolia و Ca . P. phoenicium نشان دادند و در 24 نمونه نیز دو فایتوپلاسمای Ca . P. aurantifolia و Ca. P. solani حضور داشتند. هیچکدام از نمونه ها فایتوپلاسماهای Ca . P. phoenicium و Ca. P. solani را به طور همزمان نداشتند و یا به طور مستقل به Ca. P. solani آلوده نبودند. با توجه به نتایج بدست آمده، Ca . P. aurantifolia و Ca . P. phoenicium دو فایتوپلاسمای اصلی همراه با درختان بادام مبتلا به علایم جاروی جادوگر و زردی تشخیص داده شدند. به نظر می رسد که Ca. P. solani عامل اصلی ایجاد جاروی جادوگر یا زردی درختان بادام نیست و احتمالاً به صورت آلودگی همراه با سایر فایتوپلاسماها، در تشدید علایم نقشی ایفا می کند. با توجه به انتشار هر سه گونه فایتوپلاسمایی در درختان بادام مبتلا به جاروی جادوگر، ریزبرگی و زردی در استان های اصفهان و چهارمحال و بختیاری، می توان فرض نمود که رابطه دقیقی بین گونه فایتوپلاسمایی، منطقه جغرافیایی و نوع علایم بیماری در بادام برقرار نیست. در این پژوهش تکنیک LAMP جهت ردیابی سریع Ca. P. aurantifolia و Ca . P. phoenicium در جدایه های مشکوک به بیماری جاروی جادوگر بادام به کار رفت که نتایج نشان داد که این روش برای شناسایی این فایتوپلاسما ها در نمونه های بادام قابل اعتماد است. کلمات کلیدی : جاروی جادوگر بادام، فایتوپلاسماهای بادام، طراحی آغازگر ، آلودگی مخلوط