ردیابی آلودگی‌های مخلوط فایتوپلاسمایی در بوته‌های سیب زمینی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Potato associated phytoplasmas significantly reduce quality and quantity of potato worldwide. Among the potato phytoplasmas caused diseases, potato purple top ( Candidatus Phytoplasma asteris) and potato witches’broom ( Ca . p. trifolii) with major economic effects, are the most prevalent in the world. Of the Phytoplasmas recorded in Isfahan, Ca . P. solani with high incidence and both Ca . P. trifolii and Ca . P. asteries with low incidence of occurrence have been reported from potato fields; however, no definite correlation was found between diseased plants symptoms and phytoplasma species. This finding suggests the possibility of multi phytoplasmal association with each symptomatic plant which may enhance disease severity and yield loss. To test the presence of more than one phytoplasma in individual potato plants exhibiting purple top or whiches’ broom symptoms, The potato plants showing symptoms including yellowing, stunning, purpling top, leaf rolling and having aerial tuber and swollen bud were collected from Isfahan (Damaneh, Daran, Fereydun-shahr, Chadehan and Boin-miandasht) and Chaharmahale Bakhtiari (Sharekord and Faradonbeh) potato growing area. The DNA extracted from leaf midribs and petioles of the samples were tested of by nested PCR using universal primer pair P1/P7 in the first round followed by the second round amplification using either of the specific primer pair R16F2n/R2.The PCR amplicons (1239 bp) were subjected to RFLP analysis which allowed determining different phytoplasma groups based on Cfo I digestion pattern. Sequence analysis of PCR products of primer pair R16f2n/ R2 of the representative phytoplasmas from each subgroup confirmed the presence of Ca. P. solani and Ca. P. trifolii in symptomatic potatoes, although Ca. P. asteris was not associated with the samples studied. To develop a multiplex PCR assay for simultaneous detection of mixed phytoplasma infection in diseased plants, specific primer pairs were designed based on 16- 23S rRNA and SecY gene regions of Ca . P. solani, Ca . P. trifolii and Ca. P. asteris. Among the primer sets examined in PCR reaction with known phytoplasmas, Ast-F/Ast-R (1419 bp), Ast-F/Ast-R2 (1544 bp) and Ast-F/Ast-R3 (1450 bp) were effective for individual detection of Ca. P. asteris. Primer pairs Ast-F/m2Sol-R (1274 bp) and Ast-F/Sol-R3 (1410 bp) and primer sets TRF1-F/TRF-R (1379 bp), TRF1-F/TRF-R2 (1530 bp) and TRF1-F/TRF-R3 (1430 bp) were also appropriate for detection of Ca, P. solani and Ca. P. trifolii, respectively. The results of multiplex-PCR reaction using Com-F/m2Sol-R/TRF-R3/Ast-R2 primer combination ensured simultaneous detection of three mentioned phytoplasmas by amplification of the expected bands. Of the positive samples tested, 30 samples were found infected by Ca. P. solani, two samples were identified in association with Ca. P. trifolii, and 15 samples were distinguished as mix infected by both Ca P. solani and Ca . P. trifolii; however, none of the samples was found contaminated with Ca. P. asteris. Because of the similarity between the symptoms of Phytoplasmal and Zebra chip ( Candidatus Liberibacter solanacearum) disease, to test the role of Ca Liberibacter solanacearum for development of purple top symptoms, the collected samples were assessed in nested PCR assay initially using OA2/OI2c primer pair followed by Lib16S01F/R. However, the primers did not amplify the expected DNA fragments of Zebra chip causal agents in the samples. In greenhouse assessment, the tubers of phytoplasma associated plants were grown and subjected to multiplex PCR assay for simultaneous detection of phytoplamas transmission to next generation. Of the tubers of 30 infected plants only five samples were found infected with phytoplasma which demonstrates the very low rate of phytoplasma transmission from plant to tuber and from tubers to next generation. According to the results it can be concluded that the role of insects in spread of potato phytoplasmas should be more important in Isfahan and Chaharmahale Bakhtiari potato growing fields. Keywords : Mixed infection, Candidatus Phytoplasma, PCR-RFLP, Primer Designing

فایتوپلاسماها به عنوان عوامل مهم کاهش کمی و کیفی سیب زمینی، می توانند خسارت‌های قابل توجهی به این محصول وارد سازند. تاکنون، فایتوپلاسماهای مختلفی از سیب زمینی در دنیا گزارش شده‌اند که دو فایتوپلاسمای Candidatus Phytoplasma asteris به‌عنوان عامل بیماری سرارغوانی سیب زمینی و Ca. P. trifolii به‌عنوان عامل بیماری جاروی جادوگر سیب زمینی، از اهمیت بیشتری برخوردارند. در مزارع سیب زمینی ایران فقط حضور سه فایتوپلاسمای Ca. P. solani با فراوانی بیشتر و Ca. P. trifolii و Ca . P. asteri با شیوع کمتر، تایید شده است. طی این مطالعات، همبستگی مشخصی بین نوع فایتوپلاسما و علایم بیماری‌های سرارغوانی و یا جاروی جادوگر به اثبات نرسید. با وجودیکه عوامل فایتوپلاسمایی ایجاد کننده سرارغوانی سیب زمینی و جاروی جادوگر سیب زمینی هر کدام به تنهایی می‌توانند خسارت زیادی به میزبان خود وارد کنند، اما همراهی چند فایتوپلاسمای مختلف در تشدید علایم و خسارت بیماری نیز محتمل است. به منظور بررسی آلودگی مخلوط فایتوپلاسمایی در بوته‌های سیب زمینی و امکان انتقال آنها از طریق غده به نسل‌های بعدی، طی بازدید از مزارع سیب زمینی کاری استان اصفهان (دامنه، داران، فریدون شهر، چادگان، بویین میاندشت) و استان چهار محال بختیاری (فرادنبه، شهرکرد) نمونه‌های سیب زمینی دارای علائم ریزبرگی،کوتولگی، زردی، ارغوانی و پیچیدگی برگ‌ها، تولید غده‌های هوایی و برافراشتگی همراه با ریزبرگی به همراه غده آنها، جمع آوری شدند. پس از استخراج DNA از رگبرگ‌های گیاهان جمع آوری شده، برای ردیابی عوامل فایتوپلاسمایی در نمونه ها از واکنش PCR استفاده گردید. واکنش دور اول PCR با استفاده از جفت آغازگرP1/P7 و P1A/P7A و واکنش Nested-PCR با استفاده از جفت آغازگر R16F2n\\R2 انجام شد که در 80 نمونه قطعه bp 1239 مورد انتظار تکثیر یافت. غده‌های گیاهان آلوده جهت بررسی امکان انتقال فایتوپلاسما از طریق غده به نسل‌های بعدی در گلخانه کشت گردیدند. به منظور بررسی امکان وجود تنوع گونه‌ای در فایتوپلاسماهای ردیابی شده مورد مطالعه، طی آزمون PCR-RFLP و به کمک آنزیم هضم کننده Cfo I گروه های مختلف فایتوپلاسمایی بر اساس الگوی برش تفکیک شدند و تعدادی از نمونه ها توالی یابی گردیدند. با توجه به نتایج توالی یابی، حضور دو فایتوپلاسمای Ca. P. solani و Ca. P. trifolii و عدم حضور Ca. P. asteris در نمونه های مورد بررسی ثابت شد. برای ردیابی آلودگی همزمان عوامل فایتوپلاسمایی در بین نمونه ها، آغازگرهای اختصاصی برای سه گونه مزبور فایتوپلاسمایی براساس نواحی ژنی 16-23S rRNA و SecY طراحی شد. طی واکنش PCR با نمونه های شاهد مثبت، در بین جفت آغازگرهای طراحی شده، سه ترکیب (bp 1419( Ast-F/Ast-R، (bp 1544( Ast-F/Ast-R2 و (bp 1450( Ast-F/Ast-R3 بهترین ترکیب های جفت آغازگری برای ردیابی جداگانه گونه Ca. P. asteris، چ asterisزگرهای طراحی شده، اس گونه مزبور انجام شد.ونه فایتوپلاسمابور بود.آغازگرهای اختصاصی، از آزمون بودند. همچنین، دو ترکیب آغازگری (bp 1274) Ast-F/m2Sol-R و (bp 1410) Ast-F/Sol-R3 برای ردیابی گونه Ca . P. solani و سه ترکیب آغازگری (bp 1379)TRF1-F/TRF-R، (bp 1530) TRF1-F/TRF-R2 و (bp 1430)TRF1-F/TRF-R3 جهت ردیابی Ca. P. trifolii مناسب تشخیص داده شدند. برای ردیابی توام سه گونه فایتوپلاسمایی مزبور، از ترکیب جفت آغازگری Com-F/m2SolR/TRF-R3/Ast-R2 در واکنش Multiplex-PCR استفاده گردید. با استفاده از این روش، در بین 80 نمونه که آلودگی فایتوپلاسمایی آنها با جفت آغازگر R16F2n/R2 اثبات شده بود، 30 نمونه مبتلا به Ca. P. solani، دو نمونه مبتلا به Ca . P. trifolii و 15 نمونه آلوده توام به Ca. P. trifolii و Ca. P. solani شناسایی گردید، ولی فایتوپلاسمای Ca. P. asteris در آنها ردیابی نشد که نشان دهنده انتشار و آلودگی مخلوط فایتوپلاسماهای گروه Stolbur (16SrXII) و Clover proliferation (16SrVI) در بوته های مبتلا به سرارغوانی و جاروی جادوگر در منطقه بود. به دلیل شباهت علائم بیماریهای فایتوپلاسمایی و بیماری Zebra chip ( Ca. Liberibacter solanacearum) در بوته‌های سیب زمینی، امکان حضور این پروکاریوت در نمونه‌های جمع آوری شده با استفاده از جفت آغازگر OA2/OI2c در واکنش دور اول و جفت آغازگر Lib16S01F/R در واکنش Nested PCR بررسی شد که هیچ تکثیری در پی نداشت. به این ترتیب، معلوم شد که پروکاریوت مزبور در این نمونه ها وجود ندارد. در بررسی آلودگی غده های تولید شده توسط نمونه های مبتلا به فایتوپلاسما، فقط پنج نمونه مبتلا به فایتوپلاسما در بین 30 گلدان کشت شده از غده‌های 13 گیاه آلوده قبلی ردیابی گردید که حاکی از نرخ بسیار پایین انتقال فایتوپلاسماها از گیاه به غده‌ها و یا از غده‌ها به نسل‌های بعدی است. با‌توجه به نتایج به‌دست آمده در این پژوهش، شاید بتوان گفت مهمترین عامل پراکنش فایتوپلاسمایی در مزارع سیب زمینی استان‌های اصفهان و چهار محال بختیاری ناقلین حشره‌ای هستند و غده‌های بذری از نظر انتقال بیماری اهمیت کمتری دارند.‌ طی بررسی‌های انجام شده و مقایسه نوع علائم با گونه فایتوپلاسمایی ردیابی شده، همبستگی خاصی بین نوع گونه فایتوپلاسما و نوع علایم ایجاد شده در سیب زمینی یافت نشد. کلمات کلیدی: فایتوپلاسماهای سیب زمینی، آلودگی مخلوط، طراحی آغازگر، ردیابی توام