ردیابی ژن‌های مقاومت به سفیدک پودری سیب در ژنوتیپ‌های وحشی سیب ایران

STUDENT

DEGREE

YEAR

Apple, ( Malus domesticca Borkh) is one of the most valuabale plant in Rosaceae family, because of its high nutritional and economical value, is considered as one of the important agricultural products. Apple plants are attacked by several fungal diseases (Apple Scab and Powdery mildew), bacterial diseases (Fire blight), Viral disease (Apple mosaic) and nematode (root knot). In which Powdery mildew damage is the second important after apple scab. At the end of season, by increasing buds infection, Primary inoculum will increase in next spring and also by suppressing flower bud formation, decreasing and highly damage in yield will occur. Powdery mildew caused by the obligate biotrophic ascomycete fungus Podosphaera leucotricha , is one of the main fungal diseases in commercial apple production which causes an extensive economic losses due to the negative impact on quality and quantity of apple production. Dinocap, benomyl, noarymol, are pesticides used to control it, but due to high costs and environmental problems, the use of these pesticides were faced with doubts. In recent years, the use of resistant cultivars for controling powdery mildew of apple has been considered; For this purpose the genes Pl1 , Pl2 , Pld , Plw , Plbj , etc., as well as RGA (Resistance Gene Analogs) candidate resistance genes were identified in wild genotypes. In order to detect the presence of resistance genes to the fungus P. leucotricha , 47 genotypes of wild apples, during 2014 to 2015 were collected. DNA extracted from young leaves and then SCAR and Degenerate primer pairs were used. Sequences of the genes Pl1 , Pld and Plbj in the World Database BLAST, did not alighn or its results only showed similarity with mRNA apple or pear; But alighnment related to the RGA in the database NCBI, in studied genotypes was confirmed. -LRR domains conserved and P-loop NTPase motif in -LRR-like protein which encode by the RGA in N-terminal, were confirmed in wild apple genotypes of Iran. The most common reaction catalysed by enzymes of the P-loop NTPase fold is the hydrolysis of the beta-gamma phosphate bond of a bound nucleoside triphosphate (NTP). The energy from NTP hydrolysis is typically utilised to induce conformational changes in other molecules, which constitutes the basis of the biological functions of most P-loop NTPases. This motif contained two motifs Walker A and Walker B which eventually leading to cell death in animals and plants. Proteins that are encoded by the RGA, all with motifs that play a role in pathogenicity pathways, signaling in the host plants, regulation of gene expression, transcription, cell death program and the innate immune system. Due to the lack of information about the sequences of resistance genes in gene banks which induce resistance, to powdery mildew, by Pld and Pl1 gene and Plbj gene which induce resistance to both powdery mildew and scab in apple, the gene sequences could be registered and these genes alongwith the RGAs could be used in Iranian apple breeding programs. Keywords: Powdery mildew, Podosphaera leucotricha , Resistance genes, RGA

سیب ( Malus domesticca Borkh)، یکی از ارزشمند‌ترین گیاهان خانواده Rosaceae است که به دلیل ارزش غذایی و اقتصادی بالا، یکی از محصولات کشاورزی با اهمیت محسوب می‌گردد. سیب مورد حمله بیماری‌های قارچی (لکه سیاه، سفیدک پودری، زنگ سیب- سرو، پوسیدگی تلخ و چندین بیماری دیگر)، باکتریایی (آتشک)، ویروسی (موزاییک سیب) و نماتودی (نماتود ریشه گرهی) مختلفی قرار می‌گیرد که در این میان میزان خسارت سفیدک پودری نسبت به لکه سیاه در درجه دوم اهمیت قرار دارد. سفیدک پودری سیب که توسط قارچ آسکومیست بیوتروف اجباری Podosphaera leucotricha ایجاد می‌شود، سالانه خسارات کمی و کیفی فراوانی به محصول سیب وارد می‌کند. این بیماری در انتهای فصل با افزایش درصد آلودگی جوانه‌ها باعث افزایش مایه تلقیح برای بهار سال بعد می‌گردد و همچنین با ممانعت از تشکیل جوانه گل، سبب کاهش و نابودی محصول میوه فصل بعد می‌شود. برای کنترل این بیماری از سموم دینوکارپ، بنومیل، نواریمول، تبوکونازول، فناریمول و چند سم دیگر استفاده گشته اما به علت هزینه‌های زیاد و مشکلات زیست محیطی، کاربرد این سموم با تردید‌هایی مواجه گردید. در سال‌های اخیر، استفاده از ارقام مقاوم جهت ایجاد مقاومت به بیماری سفیدک پودری سیب مورد توجه واقع گردیده است؛ به این منظور ژن‌های Pl1 ، Pl2 ، Pld ، Plw ، Plbj ، و همچنین ژن‌های RGAs (Resistance Gene Analogs) که کاندید ژن مقاومت هستند، در این سال‌ها از ژنوتیپ‌های وحشی سیب شناسایی شدند. جهت ردیابی حضور ژن‌های مقاومت به قارچ P. leucotricha در ژنوتیپ‌های وحشی سیب ایران، در سال‌های 1393-1394 از مناطق مختلفی از جمله استان‌های آذربایجان غربی، گلستان، فارس، چهار محال و بختیاری و نیز استان اصفهان، نمونه برداری شد. گونه وحشی Malus orientalis و گونه زینتی Malus floribunda ، شناسایی شد. ابتدا استخراج DNA از برگ‌های جوان انجام شد و سپس از جفت آغازگر‌های SCAR و Degenerate در واکنش PCR استفاده گردید. نتایج حاصل از توالی‌یابی ناحیه تکثیر شده در ژنوتیپ‌های مورد یررسی، به علت نبود اطلاعات مربوط به ژن‌های Pl1 ، Pld و Plbj در پایگاه داده‌های جهانی BLAST، همریف‌سازی نشد و یا نتایج حاصل از آن صرفا تشابهی را با mRNA سیب یا گلابی نشان داد؛ اما همردیف‌سازی مربوط به حضور RGAs در پایگاه NCBI، در نمونه‌های GerdA5-1 و GerdA5-2 (از استان آذربایجان‌غربی)، به عنوان شاخصی از ژنوتیپ‌های مورد بررسی، تایید گردید. دامنه‌های محافظت شده -LRR، موتیف AAA از خانواده بزرگ موتیف‌های P-loop NTPase در پروتیین -LRR-like و نیز دامنه‌ی محافظت شده NB-ARC در ناحیه N-tetminal، و همچنین ناحیه غنی از اسید آمینه لوسین در ناحیه C-terminal در دامنه LRR که توسط RGAs کد می‌شود، در نمونه‌های مذکور، مورد تایید واقع شد. موتیف P-loop NTPase پس از تجزیه‌ی زنجیره‌ فسفات بتا و گاما از NTP (Nucleotid Tri Phosphate)، انرژی حاصل از آن را به‌طور ویژه برای ایجاد تغییر در سایر مولکول‌ها به کار می‌برد و خود شامل دو موتیف Walker A و Walker B است که در نهایت منجر به مرگ سلولی هم در جانوران و هم در گیاهان می‌شود. پروتیین‌هایی که توسط RGAs کد می‌شوند، همگی دارای موتیف‌هایی هستند که در مسیر‌های تشخیص حضور بیمارگر، سیگنال‌دهی به گیاه میزبان، تنظیم بیان ژن، رونویسی، برنامه مرگ سلولی و در نهایت سیستم ایمنی ذاتی نقش دارند. این نتایج را می‌توان به سایر نمونه‌هایی که ناحیه‌ی مد‌نظر را تکثیر کردند نیز، تعمیم داد. با توجه به نبود اطلاعات مربوط به ژن‌های مقاومت در بانک ژن، که باعث ایجاد مقاومت به سفیدک پودری سیب در ژن‌های Pl1 و Pld و مقاومت توام به سفیدک پودری سیب و لکه سیاه سیب در ژن Plbj می‌شود، می‌توان نسبت به ثبت توالی‌های این ژن‌ها در بانک جهانی ژن اقدام کرده و از این ژن‌ها به همراه RGAs برای اهداف برنامه‌های اصلاح سیب به منظور ایجاد مقاومت در ارقام بومی سیب ایران استفاده نمود. کلمات کلیدی: سفیدک پودری سیب، leucotricha Podosphaera ، ژن‌های مقاومت، RGA