اثرهای Chir99021، Revresine، 5-azacytidine و همکشتی غیرمستقیم سلولهای فیبروبلاست قلبی بر تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جنین گوسفند بسمت سلولهای ماهیچه قلبی

STUDENT

DEGREE

YEAR

The aims of the present study were to: 1) evaluate the effects of addition of different concentrations of Chir99021 on expansion of ovine fetal bone-marrow mesenchymal stem cell (BM-MSCs); 2) assess the pre-treatment of MSCs with various concentration of reversine and then treatment of these cells with 5-azacytidine on cardiac differentiation of MSCs; and then 3) evaluate the best concentrations of reversine, 5-azacytdine and indirect co-culture of cardiac fibroblasts on cardiac differentiation of MSCs in in vitro culture. BM-MSCs were isolated from ovine fetal bone-marrow and cultured in DMEM:F12 medium. Surface antigens of the isolated cells were analyzed using flow-cytometry. In addition, following to 3 passages cells were examined for their differentiation capacity into osteocytes and adipose cells, in order to ensure the mesenchymal origin of the stem cells. In the first expriment, BM-MSCs from ovine fetal were plated in the presence of 0, 0.5, 1, 1.5, 3 and 5 ?M of Chir9902. During the cultivation period, the cultures were statistically compared in terms of induces of cell growth including the number of colonies, population doubling number (PDN), doubling time (DT) and the number of viable cells. Furthermore, expression of the beta-catenin was evaluated. The culture without Chir99021 was taken as the control group. In the second experiment, MTT assay was performed to determine the toxicity of 5-azacytdine and reversine. BM-MSCs were pretreated with different concentrations of reversine (0, 300, 600, 900 and 1200 nM) and then added different concentrations of 5-azacytdine (0, 5 and 10 ?M), this culture media was replaced with medium without reversine and 5-azacytidine and incubated for a period of twenty-eight days. In the third experiment: Third passage cells were used as; Treatment 1: BM-MSCs in plain media and incubated for 28 days (Control group); Treatment 2: ovine fetal cardiac fibroblasts were cultured on inserts, these inserts we applied to culture plate which were seeded with BM-MSCs (Chamber group); Treatment 3: Chamber group was supplemented with 10 µM 5-azacytidine and incubated for 48h; Treatment 4: Chamber group supplemented with 600nM reversine and incubated for 48h. After incubation, media was replaced with10 µM 5-azacytidine; the media of chambers were replaced with medium without reversine and 5-azacytidine for a period of twenty-eight days. In the second and third experiments; Expression of cardiac genes, ANP, Connexin 43, MYH6, Troponin I evaluated with Real-time RT-PCR and expression of Troponin I and alpha-actinin were used as cardiogenic markers for Immunocytochemistry and flow-cytometry. in this study , MSCs expressed CD44, CD166 and weak expression of CD34 and CD45. Oil red and Alizarin red staining indicated that the cells from all studied groups maintained the differentiation potential into adipose and osteocytes cells. In the first experiment, Our findings indicated that, addition of 0.5 and 1 µM of Chir99021 to medium significantly improved overall proliferation compared to that of control group as well as 5µM of Chir99021(p 0.05). Furthermore, Five days after treatment with small molecule showed that the treatments with 0.5 and 1 µM Chir99021 formed higher Colony Forming Unit-Fibroblast (CFU-F) compared to control and 5 µM of Chir99021. The expression of beta-catenin was significantly higher in culture supplemented with 1 ?M of Chir99021 compared to that in groups containing 0.5 and 1.5 ?M (p 0.05). In the second experiment: presence of 300 and 600 nM of reversine compared the others treatment could increase the plasticity of BM-MSCs and cardiac differentiation of these cells. In the third experiment: expression of ANP, MYH 6 and troponin I significantly increased in treatment 4 compared to other treatments and in the treatment 3 expression of connexin 43 showed significant increase and in treatment 3 and 4, expression of FGF signaling genes, MAPK1 and FGFR1 were significantly increased compared to other treatments. Although, expression of Smad2 in treatment 4 compared to other treatment significantly increased. All treatments received small molecules, either alone or as a co-culture were seen to express sarcomeric alpha-actinin and troponin I. In conclusion Chir99021 at 1 ?M could enhance in vitro proliferation of ovine fetal MSC and the high concentration of this small molecule has toxic effects on proliferation. These results indicated that addition of reversine and 5-azacytidine into culture medium could be effective on ovine MSCs differentiation into cardiomyocytes. Keywords: Chir99021, proliferation, 5-azacytidine, reversine, ovine mesenchymal stem cells, indirect co-culture, cardiomyocytes differentiation.

طب ترمیمی به منظور سلول درمانی، نیاز به تعداد فراوانی سلول زنده دارد. برای این منظور مغز استخوان استحصال شده میزان کمی سلول بنیادی مزانشیمی دارد. استفاده از کوچک مولکول های محرک مسیرهای تکثیر می تواند راهکار مناسبی برای افزایش تعداد این سلولها باشد. علاوه براین، توان تمایزی و پتانسیل بنیادی بودن این سلولها در پاساژهای متفاوت یکسان نمی باشد و با افزایش سن کاهش پیدا می کند. کوچک مولکولها می توانند برای تمایززدایی استفاده شوند بدون آنکه خطرات رد پیوند و تشکیل تومور داشته باشند. بر این اساس، هدف از این مطالعه: 1) ارزیابی تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند با افزودن غلظت های مختلف chir99021 ؛ 2) بررسی پیش تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیمی با غلظت های مختلف reversine و سپس تیمار با 5-azacytidine بر تمایز به قلب سلول‌های بنیادی مزانشیمی و 3) بررسی غلظت مناسب reversine، 5-azacytidine و همکشتی غیرمستقیم سلول‌های فیبروبلاست قلبی بر تمایز به سلول‌های ماهیچه ی قلبی در شرایط آزمایشگاهی بود. سلول‌های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جنین گوسفند جداسازی و در محیط DMEM:F12 کشت داده شدند. آنتی‌ژن‌های سطحی سلول‌های جداسازی شده با استفاده از فلوسایتومتری آنالیز شدند. علاوه براین، سلول‌های پاساژ سوم به منظور اطمینان از بنیادی بودن آن‌ها به سلول‌های استخوانی و چربی تمایز داده شدند. در آزمایش اول: سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند با غلظت های متفاوت 0، 5/0، 1، 5/1، 3، 5 میکرومولار chir99021 کشت داده شدند. در طول دوره ی کشت تیمار با دوزهای متفاوت chir99021، تعداد کلونی، دو برابر شدن جمعیت سلولی و زمان دو برابر شدن، زنده مانی سلولی مورد بررسی قرار گرفت، علاوه براین، بیان ژن بتا-کاتنین نیز ارزیابی شد. کشت بدون chir99021 به‌عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد. در آزمایش دوم: پس از انجام آزمون سمیت سلولی MTT غلظت های مختلف 5-azacytdine و reversine؛ سلول‌های بنیادی مزانشیمی با غلظت های مختلف reversine (300، 600، 900 و 1200 نانومولار) برای مدت 48 ساعت و سپس حذف این ریزمولکول و افزودن 5-azacytidine برای مدت 48 ساعت به محیط کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی در راستای تمایز به قلب و سپس کشت بدون هیچ‌گونه ریزمولکولی برای مدت 28 روز انجام گرفت. در آزمایش سوم، سلول‌های بنیادی مزانشیمی پاساژ سوم در گروه‌های تیماری زیر مورد استفاده قرار گرفتند: تیمار 1) سلول‌های بنیادی مزانشیمی برای مدت 28 روز کشت شدند؛ تیمار 2) سلول‌های فیبروبلاست قلب جنینی بر روی چاهک الحاقی (چمبر) کشت شدند که در ریز آن سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت‌شده بود (گروه چمبر)؛ تیمار 3) گروه چمبر که برای مدت 48 ساعت با 10 میکرومولار 5-azacytdine پیش تیمار شده بود؛ تیمار 4) گروه چمبر که برای مدت 48 ساعت با 600 نانومولار reversine و سپس 48 ساعت با 5-azacytidine کشت‌شده بود و درنهایت برای مدت 28 روز در محیط بدون هیچ مکملی کشت شدند. بیان ژن‌های قلبی ANP، Connexin43، MYH6 و Troponin I و ژن‌های سیگنالینگ FGFr1، MAPK1 و Smad2 به‌وسیله‌ی Real-time RT-PCR و بیان پروتئین های قلبی آلفا-اکتینین و Troponin I به‌وسیله‌ی ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه، سلول‌های بنیادی مزانشیمی نشانگرهای CD44، CD166 را بیان کردند علاوه براین، بیان CD34 و CD45 ضعیف بود. آنالیز اویل رد و آلیزارین رد نشان داد که سلول‌های جداسازی شده به سلول‌های چربی و استخوان تمایز پیدا کردند. در آزمایش اول: یافته های ما نشان داد که، افزودن غلظت های 5/0 و 1 میکرومولار chir99021 به محیط کشت در مقایسه با غلظت های 5 میکرومولار chir99021 و گروه شاهد به صورت معنی داری تکثیر را افزایش داده بودند )05/0 p ). علاوه براین، پنج روز بعد از تیمار با این کوچک مولکول، نتایج نشان داده تیمارهای 5/0 و 1 باعث افزایش تعداد کلونی در مقایسه با تیمارهای کنترل و 5 میکرومولار chir99021 می شود. غلطت 1 میکرومولار chir99021 سبب تشکیل جمعیت سلولی بیشتر و زمان دوبرابر شدن کمتری در مقایسه با سایر غلظت ها شده بود. بیان بتا-کاتنین در گروه مکمل شده با 1 میکرومولار در مقایسه با گروه‌های دریافت کننده ی غلظت های 5/0 و 5/1 به صورت معنی داری بالاتر بود )05/0 p ). بیان ژن Nanog در گروهی که 600 نانومولار reversine را دریافت کرده بود به صورت معنی داری افزایش یافته بود. در آزمایش دوم: وجود غلظت های 300 و 600 نانومولار reversine در مقایسه با سایر گروه‌های تیماری سبب افزایش میزان انعطاف پذیری سلول‌های بنیادی و تمایز آن‌ها به سمت سلول های ماهیچه ی قلبی شده است. در آزمایش سوم: بیان ANP، MYH6 و تروپونین I در گروه چمبر که هر دو کوچک مولکول را دریافت کرده بود به میزان معنی داری در مقایسه با سایر گروه‌های تیماری افزایش یافته بود. در آزمایش سوم، بیان ژن های مسیر FGF، یعنی MAPK1 و FGFr1 در تیمارهای 3 و 4 در مقایسه با سایر گروه‌های تیماری افزایش یافته است. همچنین بیان ژن Smad2 در تیمار 4 نسبت به سایر گروه‌های تیماری افزایش یافته بود. بیان آلفا-اکتیین و تروپونین I در تمامی گروه‌های تیماری که ریزمولکول را دریافت کرده بودند چه بدون همکشتی غیرمستقیم چه با همکشتی غیرمستقیم دیده شد. نتایج نشان داد که غلظت‌های 1 میکرومولارchir99021 سبب افزایش تکثیر آزمایشگاهی سلول‌های بنیادی مزانشیمی جنین گوسفند و غلظت بالای این ترکیب اثر سمی بر تکثیر دارد. این نتایج نشان می دهد که افزودنreversine و 5-azacytidine می تواند در تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جنین گوسفند به سلول‌های ماهیچه ی قلبی مؤثر باشد.