بررسی اثر اوره و فاکتور رشد اپیدرمی بر کیفیت رویانهای گاوی تولید شده در شرایط آزمایشگاهی

STUDENT

DEGREE

YEAR

The aim of this study was to evaluate the effects of urea concentrations (20 and 40 mg/dL), epidermal growth factor (EGF) and their combination on morphology characteristics of embryos and embryonic marker gene expression in Holstein dairy cow. Oocytes were collected from a slaughterhouse and randomly divided into 6 groups. Group 1 was control group. Group 2 and 3 was treated with urea (20 and 40 mg/dL, respectively). Group was treated with 10 ng/dL EGF. 5 th group treated with 20 mg/dL urea and 10 ng/dL EGF and 6 th group treated with 40 mg/dL urea and 10 ng/dL EGF. In this study the unfertilized and degenerated oocytes and then morphological characteristics of the embryo in day 3, 5 and 7 were recorded. On day 8, blastocysts were transferred to RLT solution for genetic analysis and stored at -70° C. Gene expression of Bax, Bcl2, Oct4, Nanog and Dnmt1 was assessed by Real-Time PCR. The result showed that, unfertilized and degenerated oocytes in groups treated with urea (20 40 mg/dL) increase in compare to control group. The rate of 2-16 cell zygotes had no significant difference between experimental groups. Rate of blastocyst and hatched embryos in groups treated with urea (20 40 mg/dL) were significantly decreased. The gene expression of Bax, were significantly increased in group urea (20 mg/dL) in comparison with the control group, while there was no significant difference between the control group and group treated with urea (40 mg/dL). The gene expression of Bcl2, Oct4, and Dnmt1, significantly increased in group urea (20 40 mg/dL) in compare to control group. Gene expression of Nanog, significantly decreased in group urea (20 mg/dL) in comparison with the control group, while in group treated with urea (40 mg/dL) increased. Morphological characteristics did not affect by treatments with 10 ng/dL EGF. In groups treated with 20 mg/dL urea and 10 ng/dL EGF and the group treated with 40 mg/dL urea and 10 ng/dL EGF, unfertilized and degenerated oocytes significantly increased in compare to control group. The rate of blastocyst formation was not affected by the treatment, but the rate of exit from the zona pellucida significantly reduced, while both the rate of blastocyst formation and rate of exit from the zona pellucida significantly reduced in the group treated with 40 mg/dL urea and 10 ng/dL EGF. Bax gene expression in the groups treated with epidermal growth factor was significantly lower than control group. Expression of Nanog, oct4 and Dnmt1 genes in the group treated with EGF and 40 mg/dL urea, was highest between treatments. In general, the results of this study shown that addition of urea or in combination with EGF to the maturation medium of oocytes, can affect the early embryo development and indicated the negative effect of high protein diets on reproduction in high production cows. Keywords : early embryo development, EGF, urea, bovine oocyte, IVF

هدف از این پژوهش بررسی اثرات اوره ، فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) و اثر متقابل آنها بر ویژگی های ریخت شناسی رویان ها و بیان نشانگرهای رده رویانی و مرگ سلولی بود. اووسیت های بدست آمده از کشتارگاه، به طور تصادفی به 6 گروه تقسیم شدند، این گروه ها شامل گروه کنترل (بدون افزودنی)، گروه تیمار شده با اوره به غلظت 20 میلی گرم در دسی لیتر، گروه تیمار شده با اوره به غلظت 40 میلی گرم در دسی لیتر، گروه تیمار شده با 10 نانوگرم در میلی لیتر EGF ،گروه تیمار شده با 20 میلی گرم در دسی لیتر اوره و EGF، گروه تیمار شده با 40 میلی گرم در دسی لیتر اوره و EGF. اوره و فاکتور رشد اپیدرمی با غلظت های یاد شده به محیط بلوغ تخمک ها اضافه شد. در این مطالعه ابتدا درصد اووسیت های از بین رفته و لقاح نیافته ثبت شد سپس خصوصیات مورفولوژیکی زایگوت ها در روز سوم، پنجم و هفتم آزمایش بررسی شد. در روز هشتم بلاستوسیست ها به منظور مطالعات ژنتیکی به محلول RLT منتقل و در دمای 70- درجه سانتی گراد منتقل شدند. در آزمایشات ژنتیکی بیان 3 نشانگر رده رویانی و 2 ژن آپوپتوزی شامل oct4، nanog، dnmt ،Bax و Bcl2 با روش Real-time PCR سنجیده شد. نتایج نشان داد که اوره در سطح 20 و40 میلی گرم در دسی لیتر باعث افزایش معنی دار(05/0P ) درصد تخمک های از بین رفته و لقاح نیافته در مقایسه با گروه کنترل شد. همچنین افزودن اوره با دو غلظت ذکر شده باعث کاهش معنی دار(05/0P ) درصد بلاستوسیست ها و هچینگ جنین ها در مقایسه با گروه کنترل شد. افزایش بیان رونویسی ژن مرگ سلولی Bax، در نتیجه افزودن اوره با غلظت 20 میلی گرم در دسی لیتر در سطح معنی داری(05/0P ) در مقایسه با گروه کنترل افزایش داشت. همچنین افزودن اوره با هر دو غلظت باعث افزایش معنی دار(05/0P ) در بیان ژن Bcl2 در مقایسه با گروه کنترل شد. افزودن اوره به میزان 20 میلی گرم در دسی لیتر باعث کاهش معنی دار(05/0P ) بیان ژن nanog شد، در حالی که غلظت 40 میلی گرم در دسی لیتر اوره باعث افزایش معنی دار(05/0P ) این ژن شد. افزودن EGF به میزان 10 نانو گرم به محیط بلوغ اووسیت ها در مقایسه با گروه کنترل هیچ یک از ویژگی های مورفولوژی را تحت تاثیر قرار نداد و نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی داری نداشت(05/0 P). افزودن اوره به میزان 20 میلی گرم در دسی لیتر همراه با EGF، درصد تخمک های از بین رفته و لقاح نیافته را در مقایسه باگروه کنترل افزایش داد(05/0P ) . در حالی که نرخ خروج از زونا در سطح معنی داری (05/0P )کاهش یافت. با افزودن اوره به میزان 40 میلی گرم در دسی لیتر به همراه EGF به محیط بلوغ تخمک ها، درصد اووسیت های از بین رفته و لقاح نیافته در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت(05/0P )، همچنین درصد تشکیل بلاستوسیست و خروج از زونا تحت تاثیر این تیمار، در سطح معنی داری (05/0P ) در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت. بیان ژن Bax در گروه تیمار شده با فاکتور رشد اپیدرمی در سطح معنی داری (05/0P )کمتر از گروه کنترل بود، گروه تیمار شده با غلظت 40 میلی گرم در دسی لیتر اوره به همراه EGF بیشترین (05/0P ) میزان بیان ژن پروآپوپتوتیک Bax را داشت. همچنین بیان حداکثری ژن های nanog، oct4 و dnmt1 در گروه تیمار شده با EGF به همراه گروه تیمار شده با 40 میلی گرم در دسی لیتر اتفاق افتاد. به طور کلی نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن اوره به تنهایی و یا همزمان با EGF به محیط بلوغ تخمک ها بر ویژگی های مورفولوژیکی جنین اثر گذاشته و همچنین افزودن اوره در مسیر پیام رسانی که توسط گیرنده فاکتور رشد فعال می شود تغییراتی ایجاد می کند که باعث تغییر در میزان بیان ژن های دخیل در مرگ سلولی و رشد و توسعه رویان می شود. تغییر در بیان این نشانگرها زمانی تشدید می شود که اوره با غلظت 40 میلی گرم در دسی لیتر همراه با EGF استفاده شده باشد. کلمات کلیدی : اوره، رویان های گاوی، فاکتور رشد اپیدرمال، تخمک