آنالیز بیان ژن های متالوتیونین درگیر در ذخیره سازی روی (MT4 و MT2b2) در لایه آلرون بذر جو در پاسخ به هورمون ها

STUDENT

DEGREE

YEAR

Zinc is a trace mineral essential to all life forms due to its key role in gene expression, cell development and replication. In humans, zinc is an essential cofactor for more than 300 different enzymes. The only way to absorb zinc in humans is through diet. Cereals are staple food of people in developing countries. However in cereals the presence of inhibitors like phytic acid impedes bioavailability of zinc. In addition the zinc deposited in the husk and embryo (typically 50% of the total zinc in the grain) of cereal seeds is removed during milling and polishing which resulted in remaining of low amount of zinc in endosperm fraction. Therefore, zinc biofortification of edible crops is necessary. Many genes such as metallothioneins (MTs) are involved in control the distribution of various metals throughout the plant. Based on the previous reports it seems that two MT genes, MT4 and MT2b2 are involved in accumulation of zinc in aleurone layer and embryo. therefore the in the present research expression analysis of these genes were monitored in dissected aleurone layers from barley ( Hordeum vulgare ) seeds incubated for 24 hours in the presence of the hormones, gibberellic acid (GA), abscisic acid (ABA), salicylic acid (SA), indole-3-acetic acid (IAA), kinetin (K) and ethephon (Et). The aleurone layers were also treated with a combination of hormones GA+ABA and GA+SA. Then RNA in the aleurone was extracted using SDS-based method and the cDNA was synthesized. Appropriate annealing temperature of designed specific primer pairs were determined by gradient PCR and expression of genes was evaluated by Real-Time PCR reaction. The results show that some hormones up-regulated the expression of MT4 and MT2b2 in the aleurone. An outstanding increase in the expression of these genes was observed in response to SA. Based on the recent works the protein MT4 was known as a protein with specific ability for binding to zinc. This isoform was not able to bind to other metals like cadmium. Nevertheless there was not any information about the metal-binding function of MT2b2. Therefore in this study the gene encoding MT2B2 was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector pET41a. The new construct pET41a-MT2b2 was transformed to Ecoli strain Rosetta (DE3). Following the induction with IPTG, the MT2b2 was expressed as glutathione-S-transferase (GST)-tagged fusion protein. In comparison to control strain, the cells expressing MT2b2 was more tolerant in the medium containing toxic concentration of zinc and was able to accumulate Zn 2+ . In comparison this strain was not able to accumulate cadmium which may suggest that MT2b2 is specific chelators for zinc and could be a good candidate for zinc accumulation in barley seeds. Key words: Zinc, Metallothionein, Biofortification, Real-Time PCR, Aleurone layer

عنصر روی، یک ماده معدنی کمیاب و ضروری است و نقش کلیدی در بیان ژن، رشد سلولی و همانندسازی دارد و یک کوفاکتور ضروری برای بیش از 300 نوع آنزیم مختلف است. بر اساس تجزیه و تحلیل ترکیب رژیم غذایی و نیازهای تغذیه ای، برآورد شده است که 49 درصد از جمعیت جهان در معرض خطر کمبود روی هستند. کودکان، نوجوانان، و زنان باردار، به خصوص در کشورهای در حال توسعه بیشترین افرادی هستند که در معرض خطر کمبود عنصر روی قرار دارند. دلیل اصلی کمبود روی در انسان، کمبود آن در رژیم غذایی است. در واقع بخش اعظم رژیم غذایی بسیاری از انسان ها مبتنی بر مواد غذایی غنی از نشاسته مانند برنج، گندم و جو می ‌باشد که معمولا سطح عنصر روی در این مواد کمتر از حد مطلوب است. بنابراین غنی سازی دانه غلات از لحاظ عنصر روی بسیار ضروری می باشد. ژن های مختلفی مانند متالوتیونین ها در توزیع فلزات مختلف، در سراسر گیاه درگیر هستند. مطالعات اخیر نشان می دهد دو ژن MT، MT4 و MT2b2 درگیر در انباشت عنصر روی در بافت آلرون و جنین می باشند. در این تحقیق الگوی بیان ژن های MT4 و MT2b2 در بافت های آلرون جدا شده از بذر جو ( Hordeum vulgare ) که به مدت 24 ساعت تحت تیمارهای هورمونی مختلف انکوبه شدند، دنبال شد. این تیمارهای هورمونی شامل جیبرلیک اسید(GA)، آبسیزیک اسید(ABA)، ایندول-3-استیک اسید(IAA)، سالیسیلیک اسید(SA)، کاینتین(KT) و اتفن(ET) هستند. هم چنین تیمارهای ترکیبی GA+ABA و GA+SA نیز استفاده شد. سپس محتوای RNA تمامی نمونه ها به روش مبتنی بر SDS استخراج و cDNA آن ها سنتز شد. پس از طراحی جفت آغازگرهای اختصاصی، دمای اتصال مناسب هر یک از آن ها در واکنش شیب دمایی PCR تعیین شد. بررسی بیان ژن ها به کمک واکنش Real-Time PCR انجام گرفت. نتایج آنالیز بیان ژن ها نشان داد که هورمون SA، در میان تمام هورمون ها بیشترین اثر افزایشی را بر بیان نسبی هر دو ایزوفرم MT داشت و در مقابل هورمون GA نیز بر بیان هر دو ژن، اثر کاهشی داشت. هورمون های GA+SA، ABA و ET هم، بیان نسبی هر دو MT را افزایش دادند. در این میان، هورمون های IAA و KT بیان MT2b2 را نسبت به کنترل افزایش دادند اما بر بیان MT4 نتوانستند تغییر معنا داری نسبت به کنترل ایجاد نمایند. بنابراین به نظر می رسد هورمون SA تیمار خوبی برای افزایش بیان این ژن ها است. در مطالعات اخیر نشان داده شده است که پروتئین MT4 قابلیت اختصاصی برای اتصال به فلز روی دارد به طوری که با قرار گرفتن در معرض فلزات دیگر مانند کادمیوم به آن ها اتصال پیدا نمی کند. با این وجود در مورد ویژگی های پروتئینی MT2b2 هیچ گونه اطلاعاتی وجود نداشت. بنابراین در این تحقیق ژن کدکننده MT2b2 با استفاده از RT-PCR تکثیر شد و در پلاسمید بیانی pET41a در بین دو جایگاه Eco RI و Hin dIII همسانه سازی شد. پلاسمید نوترکیب pET41a-MT2b2 به میزبان بیانی Rosetta (DE3) منتقل شد و بیان هترولوگ پروتئین، پس از القای محیط کشت باکتری با القا کننده IPTG مورد بررسی قرار گرفت. باند پروتئینی مورد نظر با وزن مولکولی مورد انتظار (KDa 98/39) بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده شد. مقاومت سویه حاصل در محیط حاوی دو فلز روی و کادمیوم به طور جداگانه بررسی شد. در حالی که سویه R-MT2b2 در محیط حاوی روی نسبت به سویه شاهد مقاومت نشان داد، رشد این سویه در محیط حاوی کادمیوم مانند سویه شاهد کاهش پیدا کرد. هم چنین سویه حاصل نوترکیب قادر به حذف فلز روی از طریق انباشت سازی آن در سلول بود در حالی که حذف فلز کادمیوم پس از کشت این سویه مشاهده نشد. بنابراین به نظر می رسد پروتئین MT2b2 نیز مانند MT4 خاصیت اختصاصی برای اتصال به فلز روی دارد. با این حال این موضوع نیاز به بررسی بیشتری دارد. کلمات کلیدی: عنصر روی، متالوتیونین، غنی سازی غلات، Real-Time PCR، لایه آلرون