ساخت و مشخصه یابی داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات/هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت جهت مهندسی بافت استخوان

STUDENT

DEGREE

YEAR

The aim of this research was the fabrication and characterization of poly (hydroxybutyrate co valerate) (PHBV) nanofibrous scaffolds containing hydroxyapatite (HA)/bredigite (BR) nanoparticles for bone tissue engineering. Hydroxyapatite/bredigite nanoparticles were synthesized using sol-gel method and its structural and morphological properties were characterized by using XRD, SEM, TEM, FTIR techniques. The results of in vitro bioactivity and cytotoxicity assessments revealed that the presence of bredigite enhanced the bioactivity and biocompatibility of composite nanoparticles. PHBV nanofibrous scaffolds containing HA, BR and HA/BR nanoparticles were fabricated using electrospinning method and characterized using SEM, TEM, DSC and FTIR. The evaluation of mechanical properties of PHBV scaffolds demonstrated that addition of nanoparticles up to 10% increased Young Modulus and tensile strength of scaffolds. Thus PHBV nanofibrous scaffolds containing 10% of HA, BR and HABR have been chosen for the rest of studies. The results of in vitro biodegradation study in buffer phosphate and in vitro bioactivity assessments in simulated body fluid revealed that the presence of all different nanoparticles improved the biodegradation and bioactivity of PHBV nanofibrous scaffolds. However PHBV scaffolds containing BR and HABR nanoparticles exhibited higher degradation and apatite formation rate than PHBV containing HA nanoparticles. In order to improve the wettability of PHBV composite nanofiber, poly l lysine (PLL) was added to PHBV scaffolds through two methods: 1) covalent attachment using EDC/NHS and 2) blending with PHBV nanofiber. The results of water contact measurements showed that water contact angle decreased from 129 to 52 degree as a result of PLL addition. The surface roughness of composite scaffold before and after treatment with PLL was study using AFM. Mean surface roughness for PHBV, PHBV/HABR, PHBV/HABR modified with PLL and PHBV/HABR blended with PLL were reported to be 329, 349, 345 and 392.9 respectively. Studies on cell–scaffolds interaction were carried out by culturing human fetal osteoblast (hFOB) cells on the scaffolds. Results of MTS study revealed the higher cells proliferation on PHBV/HABR modified with PLL scaffolds compared to other samples. PHBV/HABR modified with PLL also showed higher mineral deposition on the hFOB cells than other samples. Cell differentiation identified by alkaline phosphatase activity was significantly higher on PHBV/HABR modified with PLL compared to other scaffold. All of these results suggest that the produced PHBV/HABR modified with PLL nano?brous scaffold would be a promising candidate as an osteoconductive material for tissue engineering applications.

هدف از این تحقیق، طراحی، ساخت و مشخصه یابی داربست های نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات حاوی نانوذرات هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت جهت کاربرد در مهندسی بافت استخوان بود. ابتدا نانوذرات بریدیجیت و هیدروکسی آپاتیتی/ بریدیجیت (حاوی 25 و 50% وزنی بریدیجیت) به روش سل-ژل ساخته و خواص ساختاری و مورفولوژیکی آن با بکارگیری تکنیک های پراش پرتو ایکس، میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری و طیف سنجی تبدیل فوریه بررسی شد. زیست فعالی و زیست سازگاری نانوذرات هیدروکسی آپاتیت/ بریدیجیت ارزیابی شد و نتایج نشان داد که حضور نانوذرات بریدیجیت زیست فعالی و زیست سازگاری نانوذرات کامپوزیتی را نسبت به نانوذرات هیدروکسی آپاتیت خالص بهبود بخشید. داربست های نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات نانوذرات هیدروکسی آپاتیت، هیدروکسی آپاتیت/ بریدیجیت و یا بریدیجیت به روش الکتروریسی تهیه شد. ریز ساختار و خواص فیزیکوشیمیایی داربست های ساخته شده با بکارگیری تکنیک های میکروسکوپ الکترونی عبوری و روبشی، کالریمتری افتراقی و طیف سنجی تبدیل فوریه مطالعه و ارزیابی شد و خواص مکانیکی داربست های نانولیفی مثل استحکام کششی، ضریب یانگ و ازدیاد طول تا حدپارگی، اندازه گیری و تعیین شد. نتایج نشان داد که در غلظت 10% از هر سه نوع نانوذره، داربست های نانولیفی کامپوزیتی بیشترین مقدار ضریب یانگ و استحکام کششی نهایی را داشتند. به همین دلیل، داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات حاوی 10% نانوذره (هیدروکسی آپاتیت، هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت و یا بریدیجیت) برای ادامه مطالعات انتخاب شد. همچنین نتایج آزمون مکانیکی نشان داد که ضریب یانگ و استحکام کششی نهایی داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات حاوی 10% هیدروکسی آپاتیت و داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات حاوی 10% هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت از نظر آماری بطور معنی داری بالاتر از ضریب یانگ و استحکام کششی نهایی داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات حاوی 10% بریدیجیت بود. نتایج ارزیابی های زیست تخریب پذیری در محیط بافر فسفات و زیست فعالی در مایع شبیه سازی شده بدن، گویای این بود که حضور هر سه نوع نانوذره، زیست تخریب پذیری و زیست فعالی داربست پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات را بهبود بخشیده، درحالی که داربست های نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-بریدیجیت و پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت نرخ تخریب پذیری بیشتر و زیست فعالی بالاتری نسبت به داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت داشتند. داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت به دلیل دارا بودن خواص مکانیکی و زیست فعالی برتر نسبت به نمونه های حاوی هیدروکسی آپاتیت و یا بریدیجیت، برای ادامه مطالعات انتخاب و استفاده شد. به منظور بهبود آبدوستی و چسبندگی سلولی داربست های پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات، بیوپلیمر پلی ال لایزین از دو طریق 1) اتصال کووالانسی به روش NHS-EDC و 2) مخلوط کردن در حین اجرای عملیات الکتروریسی، به داربست پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت افزوده شد. نتایج اندازه گیری زاویه تماس آب نشان داد که بعد از بگارگیری پلی ال لایزین، زاویه تماس آب بر روی داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات از 129 درجه به 52 درجه کاهش یافت. زبری سطح داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات با بکارگیری تکنیک میکروسکوپ نیروی اتمی مورد مطالعه قرار گرفت و متوسط زبری سطح داربست های نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات، پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت، پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت -پلی ال لایزین و پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت اصلاح سطحی شده با پلی ال لایزین، به ترتیب برابر 329، 349، 345 و 9/392 نانومتر تعیین شد. به منظور بررسی تکثیر سلولی، فعالیت فسفاتاز قلیایی و میزان مینراله شدن سلولی، سلول های استئوبلاست جنین انسان (hFOB) بر روی نمونه های نانولیفی کشت داده شدند. نتایج آزمون تکثیر سلولی MTS نشان داد که رشد سلول های hFOB بر روی داربست پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت اصلاح سطحی شده با پلی ال لایزین بعد از 15 روز کشت سلول، از نظر آماری به طور معنی داری بیشتر از سایر نمونه ها بود. نتایج آنالیز میکروسکوپ الکترونی روبشی-طیف سنجی توزیع انرژی پرتوایکس و رنگ آمیزی آلیزارین رد-اس نیز تشکیل تجمعات بیشتر مینرال را بر روی سلول های کشت داده شده بر روی داربست پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت اصلاح شده با پلی ال لایزین نشان داد که بیان کننده شرکت تعداد بیشتری از سلول های hFOB در فرآیند تشکیل ماتریکس خارج سلولی مینراله می باشد. نتایج همچنین نشان داد که فعالیت فسفاتاز قلیایی سلول های hFOB بر روی داربست نانولیفی اصلاح شده با پلی ال لایزین بیشتر از سایر نمونه hy;های نانولیفی بود. بنابراین با استناد به نتایج حاصل، داربست نانولیفی پلی هیدروکسی بوتیرات کوهیدروکسی والرات-هیدروکسی آپاتیت/بریدیجیت اصلاح سطحی شده با پلی ال لایزین می تواند کاندیدای مناسبی برای کاربردهای مهندسی بافت استخوان باشد.