تنوع ژنتیکی Pyricularia oryzae عامل بیماری بلاست برنج و شناسایی توکسین‌های آن

STUDENT

DEGREE

YEAR

Rice blast [ Pyricularia oryzae Cavara] is one of the most important rice diseases throughout the world. Application of specific resistance genes to control rice blast disease, has not been sustainable. Rice blast fungus by producing new pathogenic strains capable to overcome host resistance and the biochemical origin of the blast fungus is not known precisely. In this study, 68 isolates were collected. After DNA extraction, molecular identification of isolates was performed using ITS4 / ITS5 primer pairs and then 10 microsatellite primer pairs were used to evaluate genetic structure. Data were analyzed using PowerMarker V 3.25 software and the corresponding dendrograms were drawn based on Nei 1983 and Neighbor Joining method. AMOVA analysis was performed by Alrequin V 3.1 software. In order to identify the mating type of the isolates, multiplex PCR technique was conducted using L1/L2 primers to amplify ( Mat1-1 allele), T1/T2 primers were used to amplify ( Mat1-2 allele). After the pathogenicity test, an isolate was selected to identify the toxic compounds and the extraction of fungal toxin by ethyl acetate was performed. The solvent was evaporated and dissolved in methanol. After detached leaf bioassay of extracted samples, the compounds were identified by Wiley library using GC-MS chromatography. The number of amplified alleles in fungal locus varied between 3-13 with the average of 6.87 allele per locus. The average of genetic diversity and PIC value was 0.7373 and 0.6980 respectively. The SSR marker was highly polymorphic. The population were divided into two sub-cluster. Isolates of Kalat Naderi-Khorasan Razavi province were separated from other populations that collected from Guilan and Mazandaran provinces. The F ST index (0.4437) showed slight diversity among the subpopulations of pathogen. All isolates produced a 552 bp fragment and mating type of all isolates determined as Mat1-1 . As a result of detached leaf bioassay, symptoms appeared as spots indicating the presence of phytotoxic compounds. Finally, GC-MS chromatogram analysis among the compounds identified, presence of compounds including 1,2-Benzenedicarboxylic acid-bis (2-ethylhexyl) ester (CAS), 1-Naphthalenol, 2H-Pyran-2-one, 1-Hexadecanoic acid, 9-Octadecanoic acid, Gibberellic acid, Propanoic acid, Butyric Acid and Furan were confirmed as phytotoxic compounds. The results of this study showed the ability of P. oryzae to produce toxic compounds. Key words Rice blast, Pyricularia oryzae, Genetic diversity, SSR marker, Secondary metabolites, GC-MS.

بیماری بلاست برنج [ Pyricularia oryzae ] یکی از مهم‌ترین بیماری‌های برنج در اکثر مناطق جهان به شمار می‌رود که معمولاً سالانه خسارت قابل‌توجهی روی برنج ایجاد می‌کند. استفاده از ژن‌های مقاومت اختصاصی جهت کنترل بیماری بلاست برنج در شرایط مزرعه با موفقیت دائمی و پایدار همراه نبوده است. عوامل متعددی در ایجاد تنوع ژنتیکی و نوترکیبی قارچ عامل بلاست برنج دخالت داشته‌ و با تولید نژادهای بیماری‌زای جدید قادر هستند بر مقاومت میزبان غلبه نمایند، بنابراین جهت موفقیت در اصلاح و به‌کارگیری ارقام مقاوم، مطالعه تنوع ژنتیکی و استفاده از آن‌ها برای مدیریت بیماری می‌تواند ابزار مفیدی در کمک به ایجاد لاین‌های مقاوم در هر منطقه باشد. از طرف دیگر، منشأ بیوشیمیایی بیماری‌زایی قارچ عامل بلاست دقیقاً معلوم نیست. روش‌های متابولومیک قادر به شناسایی متابولیت‌های مشتق شده از قارچ‌های فعال در محیط است و اطلاعات ارزشمندی را فراهم می‌کند تا در درک بیماری‌زایی، حساسیت یا مقاومت القایی شیمیایی مورداستفاده قرار گیرد. در این پژوهش، 68 جدایه جمع‌آوری‌شده این قارچ از مناطق عمده برنج‌کاری کشور، با استفاده از نشانگر ریز ماهواره بررسی شدند. بدین منظور، پس از استخراج DNA، تشخیص مولکولی جدایه‌های قارچی با استفاده از جفت آغازگرهای ITS4/ITS5 انجام گرفت و سپس از 10 جفت آغازگر ریزماهواره SSR برای ارزیابی تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیت‌های قارچی استفاده شد. امتیازبندی باندها در محدوده آللی مورد انتظار روی ژل واسرشت 6% پلی آکریل آمید انجام و تجزیه‌وتحلیل داده‌ها به کمک نرم‌افزار PowerMarker V 3.25 صورت گرفت. دندروگرام مربوطه بر اساس ضریب تشابه نی 1983 به روش NJ ترسیم شد. تجزیه واریانس داده‌ها نیز بر مبنای روش AMOVA با نرم‌افزار Alrequin 3.1 انجام شد. جهت تعیین تیپ آمیزشی، از تکنیک Multiplex PCR با استفاده از آغازگرهای L1 و L2 برای تکثیر (آلل Mat1-1 ) و آغازگرهای T1 و T2 جهت تکثیر (آلل Mat1-2 ) استفاده گردید. پس از انجام آزمون بیماری‌زایی جدایه‌های منتخب، یک جدایه جهت شناسایی ترکیبات توکسینی انتخاب و عمل استخراج توکسین قارچ توسط اتیل استات انجام شد. حلال توسط Rotary evaporator تبخیر و نمونه موردنظر در متانول حل گردید. پس از انجام آزمون زیست سنجی نمونه های استخراج شده روی قطعات برگ برنج، ترکیبات موجود توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی جرمی GC-MS، از طریق کتابخانه Wiley شناسایی شد. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه‌وتحلیل داده‌های SSR، تعداد آلل‌های قارچ در هر مکان ژنی از سه تا 13 آلل متغیر بود و متوسط تعداد آن‌ها در هر مکان 87/6 تعیین شد. میانگین تنوع ژنی مشاهده‌شده 7373/0و میانگین شاخص PIC، 6980/0 محاسبه گردید که بیانگر چندشکلی بالا و کارایی مناسب آغازگر SSR در تفکیک جمعیت‌های قارچی بود. به‌این‌ترتیب جمعیت‌های قارچی به دو گروه طبقه‌بندی شدند. جدایه‌های منطقه کلات نادری استان خراسان رضوی از سایر جمعیت‌ها مجزا شدند. جدایه‌های جمع‌آوری‌شده از استان‌های گیلان و مازندران نیز در یک شاخه قرار گرفتند که نشان‌دهنده نزدیکی منشأ جغرافیایی این جمعیت‌ها به یکدیگر است. مقدار شاخص F ST جمعیت‌ها نیز 04437/0 تعیین گردید که نشان‌دهنده تمایز ناچیز در زیر جمعیت‌های قارچی می‌باشد. در تعیین تیپ آمیزشی برای تمامی جدایه‌ها، فقط قطعه 552 جفت بازی تکثیر شد. بنابراین تیپ آمیزشی تمامی جدایه‌ها به‌عنوان Mat1-1 تعیین گردید. در این تحقیق، وجود تنها یکی از تیپ‌های آمیزشی در جمعیت‌های P. oryzae نشان‌دهنده عدم رخداد تولیدمثل جنسی در جمعیت‌های این قارچ است. این واقعیت بیانگر این مطلب است که جمعیت قارچ در مناطق برنج‌کاری ایران از پتانسیل تغییرپذیری ژنتیکی بسیار بالایی برخوردار نیست و تنها می‌توان عواملی نظیر جهش یا تشکیل هتروکاریون در اثر پدیده سازگاری رویشی را به‌عنوان عوامل مؤثر در بروز تغییرات ژنتیکی نام برد. در نتیجه آزمون زیست سنجی قطعات برگ برنج علائم به صورت لکه هایی با مرکز خاکستری و حاشیه قهوه ای تیره پدیدار شد که وجود ترکیبات فیتوتوکسیک را در نمونه های استخراج شده نشان می داد. در نهایت آنالیز کروماتوگرام GC-MS، از میان ترکیبات شناسایی‌شده، حضور ترکیباتی شامل 1,2-Benzenedicarboxylic acid-bis (2-ethylhexyl) ester (CAS)، 1-Naphthalenol ، 2H-Pyran-2-one، 1- Hexadecanoic acid، 9- Octadecanoic acid، Gibberellic acid، Propanoic acid، Butyric acid و Furanدر جدایه موردبررسی به‌عنوان ترکیبات فیتوتوکسینی تأیید شد. نتایج مطالعه حاضر توانایی قارچ P. oryzae را در تولید ترکیبات توکسینی نشان داد. بنابراین دخالت این توکسین‌ها در ایجاد علائم بلاست یک احتمال است و درک صحیح شیمی ترکیبات و نقش آن در بیماری‌زایی نیاز به تحقیقات بیشتر دارد و تحقیقات فعلی بستر مناسبی برای این امر فراهم می‌کند. کلمات کلیدی: بلاست برنج، Pyricularia oryzae ، تنوع ژنتیکی، نشانگر SSR، متابولیت‌های ثانویه، GC-MS.