شناسایی جدایه های ریزوبیومی حاوی ژن های موثر در رقابت و کارایی همزیستی با گیاهان خانواده لگوم

STUDENT

DEGREE

YEAR

Nitrogen is an essential nutrient for plant growth which is supplied through direct additions of chemical and organic fertilizers and biological fixation . Leguminous plants obtain their nitrogen by associating with symbiotic bacteria called Rhizobia which add significant amount of nitrogen into the soil. An economic exploitation of rhizobia-legume symbiosis needs to inoculate the legumes with the superior rhizobium strains that are efficient in nodulation and nitrogen fixation.The application of commercial rhizobia is generally unsuccessful because of ecological incompatibility and low competition of these biological fertilizers against indigenous population of rhizobia. Therefore, selection of effective and competitive indigenous rhizobium strains is essential for their applications in different regions. Some genes such as nfe , putA , acdS and melanin production genes are involved in the nodulation competitiveness ,symbiotic effectiveness and stability of rhizobia under environmental stresses. In the current study, we determined the presence of these genes in order to achieve information about nodulation competitiveness and symbiotic effectiveness of native Sinorhizobium isolates of Iran. We also investigated the ability of melanin production in rhizobial isolates of alfalfa, clover , beans, sainfoin, grass pea and pea. The specific medium was used for detection of melanin production. Among symbiotic strains of alfalfa(106 isolates), bean(55 isolates) and clover (31 isolates) , this ability was observed in 55%, 27% and 10% of isolates, respectively. According to PCR results with specific primers, the frequency of nfe , putA and acdS genes in Sinorhizobium meliloti strains isolated from alfalfa nodules was evaluated 6 %, 73% and 93%, respectively. The nfe genes are directly involved in nodulation efficiency and competitiveness of the S. meliloti and only detected in highly competitive strains nodulating alfalfa. In the present study,for competition assays, two S.meliloti strains C81-4 and A11-8 (with nfe genes) were coinoculated with 10 S.meliloti strains (without nfe genes) in different treatments. Based on the results, the nfe positive isolates showed significantly higher nodule formation ability in comparison to the nfe negative isolates by occupying 86-100% of nodules. The shoot dry weight of treatments containing C81-4 and A11-8 was 79% and 72% higher than treatments inoculated with C72-4 and B53-1 (without nfe genes) strains and the negative control (without inoculation), respectively. The A11-8 strain was examined for its competitiveness to nodulate alfalfa in two sample soil of Iran. The First soil was collected from Isfahan and the second soil was the mixture of 10 samples collected from western and central parts of Iran. The A11-8 strain was dominated for nodule occupancy in both soil samples and existed in 65% to 84% of nodules. In the first soil, shoot dry weight and the chlorophyll (a+b) contant were 92% and 94% higher than the negative control, respectively. In the second soil, the A11-8 isolate occupied 84% of nodules although there was no significant difference in shoot dry weight and the chlorophyll content. Based on the results we can say that the nfe genes have a significant role in competitiveness and nodulation efficiency of rhizobium strains but there is no clear correlation between the presence of nfe genes and the host productivity. The isolates containing nfe genes identified in this research were highly competitive for nodulation in comparison to isolates without nfe genes and native rhizobium populations in the soils. Therefore they can be appropriate candidates to produce a native biological fertilizer for Iran. Key Words: Rhizobium, Legum, Competition, Melanin, nfe , putA , acdS.

نیتروژن یکی از مهمترین عناصر مورد نیاز گیاه است که با افزودن کودهای شیمیایی و آلی به خاک و تثبیت بیولوژیک تامین می گردد. در تثبیت بیولوژیکی نیتروژن در گیاهان لگومینوز، باکتریهای ریزوبیومی خاکزی همزیست با این گیاهان دخالت دارند که به میزان قابل توجهی نیاز نیتروژنی میزبان خود را تامین می نمایند و باعث حاصلخیزی خاک نیز می شوند. بهره برداری اقتصادی از همزیستی ریزوبیوم- لگوم مستلزم تلقیح گیاه میزبان با جدایههای برتر ریزوبیومی است که توانایی گره سازی و تثبیت نیتروژن قابل توجهی داشته باشند، اما ناسازگاری اکولوژیک سویه های ریزوبیوم مورد استفاده و قدرت رقابت کم این ریزوبیوم های کارامد با ریزوبیوم های بومی موجود در ریزوسفر از جمله موانعی است که بهره برداری مناسب از ریزوبیوم های تجاری را محدود می سازد. بنابراین، انتخاب ریزوبیومهای موثر از نظر تثبیت نیتروژن و کار آمد از نظر رقابت با سایر ریزوبیومهای غیر موثر در خاک برای گره سازی در ریشه گیاه میزبان جهت کاربرد آنها در اقلیم های مختلف ضروری است. تاکنون تعدادی ژن در بعضی ریزوبیوم ها شناسایی شده است که در افزایش توان پایداری و رقابتی آنها برای گره سازی موثر است که از آن جمله می توان به ژن های nfe ، putA ، acds و ژن های مرتبط با تولید ملانین اشاره نمود. در این پژوهش جهت دستیابی به اطلاعاتی در مورد توانایی پایداری و رقابتی جدایه های ریزوبیومی بومی ایران ، حضور ژن های مذکور در میان جدایه های ریزوبیومی همزیست با یونجه ارزیابی شد و توانایی تولید ملانین در جدایه های ریزوبیومی همزیست با گیاهان یونجه، شبدر، لوبیا، اسپرس، خللر و نخود بررسی گردید. در بین 106 جدایه ریزوبیومی یونجه، 55 نمونه ریزوبیومی لوبیا و 31 جدایه ریزوبیومی همزیست با شبدر، به ترتیب %55، %27 و%10 از جدایه ها واجد ژن تولید ملانین بودند. هیچیک از جدایه های ریزوبیومی همزیست با گیاهان اسپرس(46عدد)، خللر(28 عدد) و نخود(14 عدد) قادر به تولید ملانین نشدند. ژن های putA و acds به ترتیب در میان %93 و %73 از جدایه های ریزوبیومی همزیست با یونجه ردیابی شدند و ژن های nfe در %6 از جدایه های همزیست با یونجه حضور داشت. ژن های nfe به طور مستقیم بر روی رقابت برای گره سازی تاثیر دارند و تنها در جدایه های سینوریزوبیومی با قدرت رقابت زیاد برای گره سازی در ریشه یونجه شناسایی شده اند. قدرت رقابت جدایه های سینوریزوبیومی واجد ژن های nfe ، ( جدایه های A11-8 و C81-4 ) با 10 جدایه فاقد ژن های nfe ، طی تیمارهای مختلف در آزمایشات متفاوت با گیاه یونجه مقایسه شدند. نتایج بدست آمده بیانگر قدرت رقابت بالای جدایه های nfe مثبت بود، بطوریکه در تلقیح توأمان جدایه های واجد و فاقد nfe در شرایط گلخانه ای در یونجه ، بین 86 تا 100 درصد از گره های تشکیل شده حاوی جدایه های واجد ژن های nfe بودند. در تیمار های حاوی دو جدایه nfe مثبت A11-8 و C81-4 وزن خشک اندام هوایی به میزان 79 درصد نسبت به تیمار حاوی جدایه های nfe منفی B53-1 و C72-4 و به میزان 72 درصد نسبت به تیمار شاهد منفی (بدون تلقیح باکتری) افزایش یافت. نتایج قدرت رقابت جدایه A11-8 در دو نمونه خاک مزرعه یونجه لورک - نجف آباد اصفهان و مخلوطی از 10 نمونه خاک جمع آوری شده از مناطق غربی ایران نیز حاکی از برتری گره سازی جدایه nfe مثبت در رقابت با جمعیت ریزوبیومی موجود در هر دو نمونه خاک بود، بطوریکه این جدایه ها 65 تا 84 درصد از گره های مورد بررسی در یونجه را اشغال کرده بودند. در تلقیح جدایهA11-8 به نمونه خاک لورک، وزن خشک اندام هوایی به میزان 92 درصد و میزان کلروفیل(a+b) برگ های گیاه یونجه به مقدار 94 درصد نسبت به شاهد افزایش داشت. در نمونه خاک دوم هر چند جدایه nfe مثبت در رقابت با ریزوبیوم های بومی خاک 84 درصد از گره ها را اشغال نمود ولی تفاوت معنی داری در وزن خشک اندام هوایی و میزان کلروفیل گیاه یونجه در مقایسه با تیمار شاهد مشاهده نشد. با در نظر گرفتن نتایج بدست آمده از آزمایشات مختلف می توان گفت سویه های واجد ژن های nfe در رقابت برای گره سازی در ریشه یونجه نقش بسزایی دارند، هر چند که افزایش عملکرد محصول میزبان، همبستگی مشخصی با حضور ژن های مذکور در جدایه های ریزوبیومی نشان نداد. جدایه های واجد ژن های nfe شناسایی شده در این تحقیق، در تقابل با جدایه های فاقد این ژن ها و جمعیت ریزوبیومی موجود در خاک های مورد بررسی، قدرت رقابت گره سازی بالایی داشتند و به این دلیل کاندیدای مناسبی جهت تهیه کود بیولوژیک بومی ایران می باشند. واژگان کلیدی: ریزوبیوم، لگوم، رقابت، ملانین، nfe ، putA ، acdS .