SUPERVISOR
Badraldinebrahim Seyed tabatabaei,Majid Talebi
بدرالدین ابراهیم سیدطباطبایی (استاد مشاور) مجید طالبی (استاد راهنما)
STUDENT
Hamid Akbarzadeh
حمید اکبرزاده
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1392
TITLE
Identification of some Genes Involvedin the Synthesis of ?-Sitosterol in Pomegranate (Punicagranatum)
Phytosterols including plant sterols and stanols are steroid compounds with chemical structure and biological function similar to cholesterol. Phytosterols replace cholesterol in the micelles, which are formed in the intestinal tract and reduce bloodcholesterol levels, through one or more mechanisms of competitive. Among the phytosterols, ?-Sitosterol is the most common and widely distributed in the plant kingdom. Pharmacology studieshave shown that ?-sitosterol has many immunological, microbial and pharmaceutical properties and playsa significant rolein thebiological processesof living organisms. Pomegranatehas long beenknownas ausefulfood sourcewithmanyhealth benefits. ?-sitosterol compoundswere isolated andidentifiedin some of thepomegranateplant tissues butthe genes involvedin this pathwayhave not been identified.In order toidentifyfiveterminalgenesin ?-Sitosterol pathway,primers designedaccording to theconserved regions of similarsequencesinother plants. Nucleic acids (DNA and RNA) were extracted from five different tissues (stems, leaves, flowers, seeds and skin) of three pomegranate cultivars, using CTAB-based method.Degenerative primerstestedin genomicDNA amplified non-specific bands.cDNAamplification produced specific bands, which represented that thenon-specificfragmentswere non-coding. Amplified fragments were cloned in the pTZ57R/T plasmid and transferred to E.coli strain MC1061. The recombinant plasmidswere sequenced andNCBI nucleotide blast (Blastn)identifiedsimilarsequencesin the database and confirmed the sequences. Full sequences of ALP , DEH and MET genes involved in methylation, oxidation and reduction processes, respectively, were identified using RACE-PCR reaction. Sequences of 3' and 5' ends and partial fragments of these genes were assembled and ORF and UTR regions characterized. The full length of ALP , DEH and MET genes were 1311, 1834 and 1495 bp with the ORF regions of 810, 1212 and 1278 bp, respectively. Blastn, BlastxandBlastpverified the sequences. Analysis of translated protein sequences related to ORF regions using InterPro of EMBL-EBI, ExPASy, PSIPRED and SWISS-MODEL confirmed the sequences of genes related to the synthesis of ?-Sitosterol. Expression of three full-sequenced genes in five different tissues and three cultivars of pomegranate were performed using qPCR reaction. Three internal control genes including rps9 , 18S and ef1? were used in relative quantification method for data normalization. The highest and lowest expression in all tissues and cultivars were related to DEH and MET genes, respectively. Among the tissues, the seed showed the highest level of expression for all three genes. DEH gene is the last enzyme in ?-sitosterol pathway and its higher expression leads to higher propensity of plant to the synthesis of ?-Sitosterol from all precursors. Identification of five genes associated with the end of ?-Sitosterol synthesis pathway suggests that pomegranate synthetizes ?-Sitosterol. Highexpressionof studied genesin peel andseed of thefruitrepresentsthehighsynthesisof ?-Sitosterolcompounds, especially in edibleparts oftheplant thatshowsthe importance of thepomegranateas ahealthyfood
فیتوسترول ها، شامل استرول های گیاهی و استانول ها، ترکیبات استروئیدی با ساختار شیمیایی و عملکردهای بیولوژیکی شبیه به کلسترول می باشند. فیتوسترول ها از طریق یک یا چند مکانیسم رقابتی، جایگزین کلسترول در میسل های تشکیل شده در مجرای روده شده و باعث کاهش سطح کلسترول خون می شوند. در بین استرول های گیاهی ?-Sitosterol شایعترین فیتوسترول استو به طور گسترده ای در قلمرو گیاهان توزیع شده است. مطالعات داروشناسی نشان داده که ?-sitosterolدارای خواص ایمنی، میکروبی و دارویی فراوانی است و در فرآیندهای بیولوژیک موجودات زنده نقش بسزایی ایفا می کند. گیاه انار از دیر باز به عنوان یک منبع غذایی مفید با خواص درمانی فراوان شناخته شده است. ترکیبات ?-Sitosterol از برخی از بافت های گیاه انار جداسازی و شناسایی شده اند ولی ژن های دخیل در مسیر بیوسنتز آن ها در این گیاه شناسایی نشده است. به منظور شناسایی پنج ژن انتهایی مسیر سنتز ?-Sitosterol، طراحی آغازگر از نواحی حفاظت شده توالی های مشابه که در گیاهان دیگر شناسایی شده بودند، انجام پذیرفت، سپس محتوی اسید نوکلئیک (DNA و RNA) پنج بافت مختلف (ساقه، برگ، گل، دانه و پوست) از سه ژنوتیپ گیاه انار، به روش مبتنی بر CTAB استخراج شد. عملکرد آغازگرها روی مولکول DNA بررسی شد. آغازگرهای طراحی شده دارای نواحی چند نوکلوتید مخلوط بودند، به همین دلیل تمایلشان برای تکثیر قطعه مورد نظر بسیار پایین بود و قطعات غیراختصاصی زیادی همراه با قطعه مورد نظر تکثیر نمودند. سپس برای تکثیر نواحی اگزون ژن های مورد نظر، واکنش PCR با آغازگرهای فوق روی مولکول cDNA انجام گرفت. در این واکنش قطعات هدف بدون باندهای غیراختصاصی تکثیر شدند که این امر نمایانگر عدم بیان قطعات غیراختصاصی تکثیر شده می باشد. قطعات تکثیر شده در این مرحله، در پلاسمید pTZ57R/T همسانه سازی و سپس به باکتری E.coli سویه MC1061 منتقل شدند. پلاسمیدهای نوترکیب برای توالی یابی ارسال شدند. پس از همردیف سازی توالی های خوانش شده در پایگاه داده NCBI، مشابهت توالی های شناسایی شده با توالی های مشابه در پایگاه داده تایید گردید، سپس شناسایی توالی کامل نواحی اگزون ژن های ALP، DEH و MET که به ترتیب فرآیندهای متیلاسیون، اکسیداسیون و احیا را سنتز می کنند، طی فرآیند RACE-PCR و با استفاده از نواحی ناقص شناسایی شده در مراحل قبلی، انجام گرفت. پس از جداسازی قطعات مورد نظر از توالی های خوانش شده، توالی های 3َ و 5َ و قطعات ناقص شناسایی شده در مرحله قبل، کنار هم قرارداده شدند و توالی کامل ژن با شناسایی نواحی ORF و UTR، مشخص شد. ژن ALP به طول bp 1311 و ناحیه ORF آن bp 810، ژن DEH به طول bp 1834 و ناحیه ORF آن bp 1212 و ژن MET به طول bp 1495 و ناحیه ORF آن bp 1278 بدست آمد. همردیف سازی توالی ها در پایگاه داده NCBI توسط Blastn، Blastx و Blastp انجام شد و مشابهت توالی های شناسایی شده با توالی های مشابه در پایگاه داده تایید شد. توالی های پروتئینی مربوط به نواحی ORF ژن های شناسایی شده توسط پایگاه های EMBL-EBI و بخش InterPro ، ExPASy، PSIPRED وSWISS-MODEL مورد مطالعه قرارگرفتند و صحت شناسایی توالی های مربوط به ژن های سنتز کننده مسیر بیوشیمیایی ?-Sitosterol را تاییدکردند. به منظور بررسی بیان سه ژن فوق واکنش qPCR روی 15 مولکول cDNA متعلق به پنج بافت مختلف از سه ژنوتیپ گیاه انار به همراه سه ژن کنترل داخلی rps9 ، 18S و ef1? جهت نرمال سازی داده ها در کمیت سنجی نسبی، انجام گرفت. نتایج مطالعه بیان ژن نشان داد که تقریباً در تمامی بافت ها و ژنوتیپ ها بالاترین بیان مربوط به ژن DEH می باشد و پایین ترین بیان مربوط به ژن MET بود. در بین بافت های مختلف گیاه انار بافت دانه بیشترین بیان را برای هر سه ژن نشان داد. ژن DEH یکی از آنزیم های انتهایی مسیر سنتز ?-Sitosterol را کد می کند و بیان بالاتر آن نسبت به دو ژن دیگر مبین تمایل بالای گیاه به سنتز ?-Sitosterol از تمامی محتوی پیش ماده تولیدی توسط آنزیم های قبلی است. شناسایی پنج ژن انتهایی مسیر سنتز ?-Sitosterol وجود این مسیر بیوشیمیایی را در گیاه انار نشان می دهد. بیان بالاتر ژن های انتهای مسیر در بافت پوست و دانه میوه انار نشان دهنده سنتز بالاتر این ترکیبات بویژه در بخش های خوراکی این گیاه است که اهمیت انار را به عنوان یک غذای سلامت نشان می دهد. کلماتکلیدی: انار،فیتوسترول، ?-Sitosterol، RACE-PCR، qPCR