SUPERVISOR
آذر شاه پیری (استاد راهنما) ایوب آرپنایی (استاد راهنما)
STUDENT
Mohsen Zarei
محسن زارعی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1390
TITLE
Immobilization of Recombinant Form of Rice Metallothionein Type 1 (OsMTI-1b) on Silica-coated Iron Oxide (Fe3O4) Nanoparticle
The presence of heavy metals such as cadmium in water resources is becoming a severe environmental and public health problem. Many removal techniques have been used such as adsorption, chemical precipitation, ion exchange, and reverse osmosis to remove of heavy metals pollutant. Adsorption method is one of the common methods because it is simple, low-cost, effective and flexible in design and operation. Nowadays nanoscale adsorbents specially magnetic nanoparticles as iron oxide nanoparticles (Fe 3 O 4 ) which magnetically separable are used for wastewater treatment. Functional group present on the surface of these nanoparticles is one of the important factors which determines adsorption capacity. By use of capability of immobilization of protein on this nanoparticles, we can immobilise heavy metal chelating protein as metallothionein, on this nanoparticle and adsorption capacity improve will be expected. The aim of this study was to immobilisation of OsMTI-Ib metallothionein isoform on silica-coated iron oxide (Fe3O4@SiO 2 ) nanoparticles and investigation of effect of this protein on cadmium (CdCl 2 .H 2 O) adsorption capacity of nanoparticles. OsMTI-Ib isoform was heterologously expressed in Escherichia coli strain Rosetta (DE3). The activity of protein for sorption of cadmium was confirmed by DTNB test and measurement of cadmium content in protein using atomic absorption spectroscopy (AAS). Nanoparticles were amino-functionalized using (EDS), then used to immobilization of protein. Nanoparticles surface were activated by glutaraldehyde. The protein was immobilized by covalent attachment and protein loading capacity (w/w %) on nanoparticles was calculated 40± 1.5 %. Nanoparticles containing protein and nanoparticles without protein were incubated for two hours with cadmium and amount of remaining cadmium was measured. Adsorption capacities of these nanoparticles were calculated. Comparison of adsorbed cadmium on nanoparticles containing protein and nanoparticles without protein showed that the nanoparticles containing protein due to have more amount of cadmium adsorption site have more adsorption capacity. In the nanoparticles without protein, cadmium ion was adsorbed by the coordination between cadmium ion and amino groups. In nanoparticles containing protein, thiol groups of protein adsorbed cadmium via mercaptid bound. The Effect of time on the amount of sorption indicated that the adsorption capacity in both of nanoparticles increased with increasing of time. Investigation of kinetic models of adsorption process has shown that in the both of adsorbent, adsorption process controlled by pseudo-second-order kinetic model. Investigation of the effect of initial concentration of cadmium on adsorption capacity showed that the adsorption capacity increased with increasing of initial concentration. Investigation of adsorption isotherm models has shown that the experimental data were fitted to the Langmuir model. According to this model the maximum adsorption capacities for nanoparticles containing protein and nanoparticles without protein were 477.88 mg/g and 315.8 mg/g respectively. Investigation of the effect of pH showed that in the both of nanoparticles, adsorption capacity decreased with decreasing of pH. The decreasing of adsorption capacity attributed to the high concentration of H + . By increasing of concentration of H + , more amino and thiol groups protonated and competition between H + and Cd 2+ for attaching to surface of sorbent increased. Investigation of recovery and reusability of nanoparticles containing protein and nanoparticles without protein showed that these nanoparticles retained more than 70% of their initial activities after 3 and 4 times’ reuse respectively. The decreasing of activity was probably due to the change in protein structure, separation of silica cover or lose of nanoparticles in recovery process. Results of this study showed that the immobilization of OsMTI-Ib isoform on Fe3O4@SiO 2 nanoparticles improved the cadmium adsorption capacity in these nanoparticles. Key words : Iron oxide nanoparticles, Immobilization of protein, Metallothionein, Pseudo-second-order kinetic model, Langmuir model
وجود فلزات سنگینی همچون کادمیوم در منابع آبی باعث بروز مشکلات زیست محیطی متعدد و تهدید سلامت عمومی شده است. در بین روش هایی مثل جذب، رسوب دهی شیمیایی، تعویض یون و اسمز معکوس، که برای حذف آلودگی های فلزی مورد استفاده قرار می گیرند، استفاده از روش جذب به دلیل سادگی، هزینه کم، کارایی بالا و انعطاف پذیری در طراحی و عمل عمومیت بیشتری دارد. امروزه از جاذب هایی در مقیاس نانو به ویژه نانوذرات مغناطیسی مثل نانوذرات اکسید آهن(Fe 3 O 4 ) که قابلیت جداسازی مغناطیسی دارند، استفاده می شود. یکی از عوامل مهم در تعیین ظرفیت این نانوذرات، گروهای عاملی موجود بر سطح آنها می باشد. با بهره گیری از قابلیت تثبیت پروتئین بر نانوذرات می توان پروتئین های کلاته کننده فلزات سنگین، مثل متالوتیونین را بر سطح این نانوذرات تثبیت کرد و انتظار داشت که قابلت جذب فلز در آنها بهبود یابد. هدف از این تحقیق تثبیت پروتئین متالوتیونین برنج (ایزوفرم OsMTI-Ib) بر سطح نانوذرات اکسید آهن پوشش دار شده با سیلیکا (Fe 3 O 4 @SiO 2 ) و بررسی تاثیر این پروتئین بر ظرفیت جذب کادمیوم (CdCl 2 .H 2 O) توسط نانوذرات بود. ایزوفرم OsMTI-Ib به صورت نوترکیب در باکتری تراریخت Escherichia coli سویه Rosetta (DE3) تولید و فعال بودن پروتئین برای جذب کادمیوم به وسیله تست DTNB و اندازهگیری محتوی کادمیوم پروتئین به وسیله طیف سنجی جذب اتمی (AAS) تائید شد. به منظور تثبیت پروتئین از نانوذرات آمین دار شده به وسیله ان - (2-آمینو اتیل) -3- آمینوپروپیل تری متوکسی سیلان (EDS) استفاده شد. بعد از فعال سازی سطح نانوذرات آمین دار شده به وسیله گلوتارآلدئید، پروتئین به صورت کوالانسی بر سطح نانوذرات تثبیت و درصد ظرفیت بارگذاری پروتئین (w/w%) بر نانوذرات 5/1 ± 4/40 % محاسبه شد. بعد از قرار دادن نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین به مدت دو ساعت در معرض کادمیوم مقدار باقیمانده کادمیوم با طیف سنجی جذب اتمی اندازه گیری و ظرفیت جذب این نانو ذرات محاسبه شد. مقایسه ظرفیت جذب کادمیوم بر نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین نشان داد که نانوذرات حاوی پروتئین به دلیل دارا بودن مقادیر بیشتری از جایگاه های اتصال کادمیوم ظرفیت جذب بیشتری داشتند. در نانوذرات بدون پروتئین کئوردیناسیون بین یون کادمیوم و گروه آمین عامل جذب کادمیوم بر سطح نانوذرات بود و در نانوذرات حاوی پروتئین، گروه های تیول موجود در پروتئین، یون های کادمیوم را از طریق پیوندهای مرکاپتیدی جذب کردند. تاثیر زمان بر مقدار جذب نشان داد که با افزایش زمان در هر دو نانوذره ظرفیت جذب افزایش یافت. در این رابطه بررسی مدل های سینتیکی فرآیند جذب نشان داد که در هر دو جاذب، فرآیند جذب به وسیله مدل سینتیکی شبه مرتبه دوم کنترل گردید. بررسی اثر غلظت اولیه کادمیوم بر ظرفیت جذب نشان داد که با افزایش غلظت، ظرفیت جذب تا حدی که نانوذرات به حد اشباع درآیند، افزایش یافت. بررسی مدل های ایزوترم نشان داد که مدل لانگمیر با داده های آزمایشگاهی توافق بهتری داشت و با استفاده از این مدل مقدار حداکثر ظرفیت جذب نانوذرات حاوی پروتئین و نانوذرات بدون پروتئین به ترتیب mg/g 88/474 و mg/g 8/315 محاسبه شد. بررسی تاثیر pH بر ظرفیت جذب نانوذرات نشان داد که در هر دو نانوذره با کاهش pH ظرفیت جذب کاهش یافت که علت آن افزایش H + و در نتیجه افزایش فرم پروتونه گروهای آمین و گروهای تیول و همچنین رقابت بین H + و Cd 2+ برای اتصال به سطوح جذب بود. بررسی قابلیت بازیابی و استفاده مجدد از نانوذرات نشان داد که نانوذرات حاوی پروتئین بعد از سه مرتبه استفاده مجدد، بیش از 70 % از فعالیت اولیه خود را حفظ کردند و این مقدار کاهش فعالیت می توانست مربوط به تغییر در ساختمان پروتئین یا از دست رفتن نانوذرات حین مراحل بازیابی باشد. این بررسی در نانوذرات بدون پروتئین نشان داد که این ذرات بعد از چهار مرتبه استفاده مجدد، بیش از 70 % از فعالیت اولیه خود را حفظ کردند. کاهش ظرفیت جذب در این ذرات می توانست مربوط به جداشدن پوشش سیلیکا یا از دست رفتن نانوذرات حین مراحل بازیابی باشد. نتایج این تحقیق نشان داد که تثبیت ایزوفرم OsMTI-Ib متالوتیونین بر سطح نانوذرات ظرفیت جذب در این نانوذرات را بهبود بخشید. واژگان کلیدی : نانوذرات اکسید آهن، تثبیت پروتئین، متالوتیونین، مدل سینتیکی شبه مرتبه دوم، مدل لانگمیر