Skip to main content
SUPERVISOR
Azar Shahpiri
آذر شاه پیری (استاد راهنما)
 
STUDENT
Hadiehalsadat Eslampanahseyedi
هدیه السادات اسلام پناه سیدی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1387

TITLE

Isolation, Cloning and Expression of Two Genes Encoding NADPH - Dependent Thioredoxin Reductase From Rice (Oryza sativa)
An NADP/thioredoxin system, consisting of NADPH, NADP-thioredoxin reductase (NTR), and its thioredoxin, thioredoxin h (Trxh) plays important role in the cell by reducing disulfide bonds in target proteins involved in different cellular process. NTR utilizes NADPH to catalyse the conversion of oxidized Trx into reduced Trx. Reduced Trx provides reducing: (i) Trx peroxidase, wich breaks down H 2 O 2 to water, (ii) ribonucleotide reductase, which reduces ribonucleotides to deoxyribonucleotides for DNA synthesis, and transcription factors, which leads to their increased binding to DNA and altered gene transcription. In addition, Trx increases cell growth and inhibits apoptosis. Plants contain multiple forms of Trx that are classified based on their primery and sub-cellular localization. The reduction of cytosolic and mitochondrial types of Trx is dependent on NADPH and catalyzed by NADPH-dependent reductase. In contrast to prokaryotic and mammalian cells, plants have a complex NTR/Trx system comprising several Trx h and NTR isoforms. Therefore, one important question to be addressed is whether there is specificity in the interactions between different NTR and Trxh isoforms. Through search in rice ( oryza sativa ) genome database, we identified nine potential genes encoding Trxh and four potential genes encoding NTR. We aim to produce purified recombinant forms of rice NTR which will enable us to analyze invitro interaction between different isoforms of NTR and Trxh from the same organism and other organisms. Here we describe isolation, cloning, expression, purification and biochemical characterization of two full length cDNAs encoding NTR, OsNTR1 and OsNTR2, from rice. The polypeptide deduced from these cDNAs shows high similarity with plant cytoplasmic or mitochondrial type NTR (A/B NTR) containing an FAD- and NADP-binding domain and an active site. For OsNTR1 coding sequences, then extraction of total RNA from shoot and RT-PCR, amplified fragments was cloned in pJET1/2 blunt cloning vector. Since OsNTR2 was not expression in 7 old rice tissues, OsNTR2 coding sequences was synthesis in pUC57 cloning vector with Genescript Company. The restriction sites EcoR I and Hind III were introduced the ends of the OsNTR1 and OsNTR2 coding sequences, after cleavage by the appropriate restriction enzymes, the inserts were ligated into pET28a expression vector. Sequences were verified by sequencing, then constructs transformed into the expression host Rosetta (DE3) and subsequently induced with IPTG to produce the recombinant proteins. Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE, indicated that OsNTR1 and OsNTR2 were present as soluble and insoluble fraction but were found mostly in the insoluble fraction. We were increasing solubility of recombinant proteins with optimization of growth condition by reducing of temperature and concentration of IPTG. In th
سیستم NADP- تیوردوکسین متشکل از NADPH، NADP- تیوردوکسن ردوکتاز (NTR) و تیوردوکسین h(Trx h)است که با احیا باندهای دی سولفیدی پروتئین‌های هدف شرکت‌کننده در فرآیندهای مختلف سلولی، نقش مهمی را در سلول ایفا می‌کند. مولکول های Trx زمانی که از طریق NADPH به وسیله تیوردوکسین ردوکتاز به فرم احیا درمی‌آیند، به عنوان فاکتورهای رشد سلولی عمل کرده و از فرآیند مرگ سلولی برنامه ریزی شده، جلوگیری می‌کنند. با احیاء ریبونوکلئوتیدها به دی‌اکسی ریبونوکلئوتید‌ها، در سنتز DNA دخالت دارند و با تاثیر بر فاکتورهای رو‌نویسی، در بیان ‌ژن اثر می گذارند. با احیاء تیو‌ردوکسین پراکسیداز ‌ها منجر به شکسته شدن مولکول 2 O 2 H به مولکولO 2 H شده و در نتیجه به‌ عنوان آنتی‌اکسیدان عمل می?کنند. سیستم h NTR/Trx در گیاهان به دلیل وجود ایزوفرم‌های چندگانه از NTR وh Trx در مقایسه با پروکاریوت ها و جانوران، پیچیده‌تر است. بدین ترتیب سوالی در رابطه با میزان اختصاصی بودن عمل هر یک از ایزوفرم های NTR در واکنش با ایزوفرم های Trx h مطرح می گردد. با جستجو در پایگاه ژنومی برنج ( oryza sativa )، نه ژن کدکننده برای Trx h و چهار ژن کدکننده برای NTR شناسایی شد. هدف از این تحقیق، تولید فرم های نوترکیب خالص از NTRهای گیاه برنج است که ما را به بررسی روابط متقابل میان ایزوفرم های مختلف NTR و ایزوفرم های Trx h از گیاه برنج و ارگانیسم های دیگر، قادر خواهد ساخت. در این تحقیق به شرح جداسازی، همسانه‌سازی، بیان، خالص سازی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی دو توالی کامل cDNA کد کننده دو NTR برنج به نام‌‌های OsNTR1 و OsNTR2 پرداخته شده است. پلی‌پپتیدهای حاصل از این توالی‌ کدکننده، شباهت بالایی را به NTRهای نوع سیتوزولی و میتوکندریایی گیاهی (A/B NTR) نشان می‌دهند که دارای دومین متصل به FAD، NADP و جایگاه فعال در ساختار خود هستند. در تحقیق حاضر، توالی کدکننده OsNTR1 با استخراج RNA از بافت ساقه هفت روزه وانجام RT-PCRجداسازی گشت و در پلاسمید blunt pJET1/2 همسانه‌سازی شد. از آنجا که بیان OsNTR2 در بافت های هفت روزه برنج تایید نگردید، توالی کدکننده OsNTR2 توسط شرکت Genescript سنتز و در پلاسمید pUC57 قرارگرفت. با توجه به این که، جایگاه‌های برشی EcoR I و Hind III در دو طرف توالی کدکننده OsNTR1 و OsNTR2 تعبیه شده بود، پس از برش قطعات ORF با این آنزیم‌های برشی ، این قطعات در ناقل بیانی pET28a همسانه‌سازی شدند. توالی‌ها پس از این‌که از طریق توالی‌یابی مورد تایید قرارگرفتند، به میزبان بیانی Rosetta (DE3) ( سویه‌ای از باکتری E.coli ) منتقل شدند و به منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب با IPTG القا گشتند. بیان پروتئین‌های نوترکیب از طریق SDS-PAGE بررسی شد و هریک از پروتئین‌های نوترکیب OsNTR1 و OsNTR2 هم در فاز محلول و هم غیر محلول مشاهده شدند که بخش عمده آن‌ها در فاز نامحلول قرار می‌گرفت. از این رو با بهینه‌سازی شرایط ‌کشت از طریق کاهش دما و کاهش غلظت IPTG به کار رفته در محیط کشت، حلالیت پروتئنین‌های نوترکیب افزایش یافت. در مرحله بعد پروتئین‌های His 6- OsNTR1 و His 6- OsNTR2 با کمک کروماتوگرافی جذبی بر روی ستون نیکل با موفقیت خالص سازی شدند. پروتئین‌های خالص شده زرد رنگ و دارای الگوی اسپکتروفوتومتری مشابه با دیگر فلاووپروتئین‌ها بودند. بدین ترتیب، تولید فرم‌های نوترکیب خالص در مقیاس

ارتقاء امنیت وب با وف بومی