جداسازی، همسانه سازی و بیان هترولوگ سه ژن کد کننده ی تیوردوکسین نوعh ا (OsTrxh1، OsTrxh20 و OsTrxh23) از گیاه برنج Oryza sativa

STUDENT

DEGREE

YEAR

Thioredoxins are small ubiquitous proteins with a redox active disulfide bridge present in the characteristic active site sequence WCG/PPC. These proteins can participate in thiol-disulfide reactions via two cysteines residues of their active site motif. They have a molecular mass of approximately 12-14 kDa and are universally distributed in all organisms from prokaryotes to higher eukaryotes. Plants contain several forms of Trxs. Thioredoxin f, m, x and y are found in the chloroplast, Trxo is localized in mitochondria and Trxh is typically cytosolic. Trxh have been found to have an important role in plants development. In cytosol, electrons flow from NADPH through Trxh by NADPH Thioredoxin Reductase (NTR). A total of 30 loci with 54 gene models encoding putative Trx proteins were identified in the Rice genome. The number of 9 genes are Trxh encoding genes. Despite of widespread studies on NTR/Trx system in plants, the function of each isoform, had not been characterized yet. In the present study, the gene encoding OsTrxh23 was isolated from shoots of Oryza sativa L 2 seedlings, 7 days after germination by Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) method and then the RT-PCR products was cloned in to pJET cloning vector. In order to produce recombinant protein, the gene was cloned in to pET-15b expression vector which contains T7 promoter and His-Tag region. The recombinant expression vector, was transferred to the Rosetta (DE3) - a strain of Escherichia coli . After induction with Isopropyl-?-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), proper amount of recombinant protein his6-OsTrxh23 was produced. On the other hand, the genes encoding isoforms OsTrxh1 and OsTrxh20 , which were cloned in pUC57 vector beforehand, were cloned in pET-15b and the recombinant forms of these proteins – His6-OsTrxh1 and His6-OsTrxh20- were produced. The recombinant proteins in the supernatant were purified by affinity chromatography using His-Trap columns. The recombinant Trxh isoforms were analyzed for their ability to reduce Insulin – a general substrate for Trxs- and also DTT, as a reducing agent. Afterwards, the time courses of insulin reduction by purified recombinant Trxs in A650 were calculated by Excel program. The results showed that all three isoforms were active. Among the three isoforms, OsTrxh23 had the highest activity level with 0.0588 A650.S -1 , whereas OsTrxh1 showed the minimum activity level with 0.022 A650.S -1 . Regarding to the point that there were two cysteines at the N-terminal of Ostrxh20 and only 1 cysteine existed in OsTrxh1 and OsTrxh23 N-terminal, the possibility of dimer formation was increased and finally, the SDS-PAGE results of preparing protein samples in presence and absence of DTT, confirmed this hypothesis that Trxs can form both monomer and dimer constructions. The analysis of phylogenetic tree of different

تیوردوکسین ها ( Trxs) پروتئین های کوچکی با وزن مولکولی kDa 14-12 هستند که در تمام پروکاریوت ها و یوکاریوت ها یافت می شوند. این پروتئین ها با داشتن یک گروه تیول – دی سولفید در جایگاه فعالشان (WCG/PPC)، در احیاء برگشت پذیر پیوند های دی سولفیدی نقش دارند. ایزوفرم های مختلفی از Trx در گیاهان وجود دارد. ایزوفرم های f، m، x و y در کلروپلاست، Trx o در میتوکندری و نوع h در سیتوزول، یافت می شوند. Trxh دارای اهمیت اساسی در رشد و نمو گیاه است. در سیتوزول، الکترون ها توسط تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به NADPH (NTR)، از NADPH به Trxh منتقل می شوند. در ژنوم برنج، 30 جایگاه ژنی با 54 مدل ژنی برای Trx وجود دارد. از این میان، 9 ژن، کد کننده ی Trxh می باشد. علی رغم تحقیقات زیادی که بر روی سیستم NTR/Trxh در گیاهان صورت گرفته است، وظیفه و عملکرد هر ایزوفرم به طور اختصاصی مشخص نمی باشد. در تحقیق حاضر، توالی ژن کد کننده ی ایزوفرم OsTrxh23، با استفاده از روش RT-PCR، از اندام هوایی گیاهچه های 7 روزه ی برنج Oryza sativa رقم L 2 ( 7 روز پس از جوانه زنی بذر)، جداسازی و سپس در پلاسمید خطی pJET، همسانه سازی شد. جهت تولید پروتئین نوترکیب، این ژن در پلاسمید بیانی pET-15b، که دارای پروموتر T7 و ناحیه ی کد کننده ی His-tag بود، همسانه سازی شد. پلاسمید بیانی نوترکیب حاصل، به سویه ی مناسبی از باکتری Escherichia coli به نام Rosetta (DE3) منتقل شد. با تحریک پروموتر T7 به وسیله ی IPTG، میزان مناسبی از پروتئین نوترکیب His6-OsTrxh23 تولید گردید. از طرفی، ژن های کد کننده ی ایزوفرم های OsTrxh1 و OsTrxh20 ، که قبلا" در پلاسمید pUC57، همسانه سازی شده بودند نیز در پلاسمید بیانی pET-15b مورد همسانه سازی قرار گرفته و پس از انتقال به سویه ی Rosetta (DE3)، شکل نوترکیب پروتئین های His6-OsTrxh1 و His6-OsTrxh20 نیز تولید گردید. با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی، سه پروتئین الحاقی حاصله خالص سازی شدند و خصوصیات شیمیایی و کینتیکی آن ها مقایسه شد. جهت بررسی فعالیت کینتیکی پروتئین های نوترکیب تولید شده، از انسولین به عنوان سوبسترای عمومی Trx و همچنین DTT به عنوان عامل احیا کننده استفاده شد. سپس با استفاده از برنامه ی Excel، نمودار جذب نور در A 650 بر حسب زمان رسم و شیب خط محاسبه شد. نتایج نشان داد، هر سه ایزوفرم نوترکیب تولید شده، فعال بودند، به طوریکه در مقایسه با نمونه ی شاهد، جذب نور در A 650 ، افزایش پیدا کرد. در بین سه ایزوفرم مورد مطالعه، OsTrxh23 با A650/min معادل 0588/0 دارای بیشترین فعالیت و OsTrxh1 با A650/min معادل 022/0، دارای کمترین میزان فعالیت بود. با توجه به اینکه در انتهای آمین OsTrxh20، دو اسید آمینه ی سیستئین و در انتهای آمین OsTrxh1 و OsTrxh23، یک سیستئین وجود داشت، وجود این سیستئین ها در محلی غیر از جایگاه فعال، احتمال اینکه، بعضی از مولکول های این سه ایزوفرم، با استفاده از پیوند های دی سولفیدی، به شکل دایمر و برخی دیگر به شکل مونومر باشند را تقویت کرد که الکتروفورز نمونه ها بر روی ژل SDS-PAGE در شرایط عدم حضور DTT این مطلب را تایید نمود. همچنین تجزیه و تحلیل درخت فیلوژنتیک ترسیم شده برای ایزوفرم های مختلف Trxh در گیاهان مختلف نشان داد که ایزوفرم OsTrxh23 در حالیکه با ایزوفرم های OsTrxh1 و OsTrxh20، دارای 37 درصد شباهت در توالی است، اما با ایزوفرم TaTrxh3