ساخت آپتاحسگر الکتروشیمیایی جهت ردیابی شیگلا دیسانتری در شیر و آب

STUDENT

DEGREE

YEAR

This work introduces a novel sensitive aptasensor, developed for S. dysenteriae as one of the most important foodborne pathogens. For fabrication of the aptasensor, gold nanoparticles (G) were electrodeposited on a glassy carbon electrode (GCE) surface. Then thiolar aptamer were self-assembled with G/GCE and free G were covered by 6-mercapto-1-hexanol (MCH). Size, morphology, and distribution of the G were characterized by field emission scanning electron microscope (FE-SEM). Detection of S. dysenteriae was performed using charge transfer resistance (Rct) of the aptasensor, and it was also confirmed by atomic force microscopy. The interaction between the aptamer and outer- membrane proteins of S. dysenteriae lead to an increase in the Rct. The fabricated aptasensor has a wide linear dynamic range at a concentration range of 10 1 -10 6 CFU mL -1 with a limit of detection (LOD) of 10 0 CFU mL -1 . The selectivity of this reproducible aptasensor was examined. The aptasensor can differentiate between alive S. dysenteriae and other pathogens, and also dead S. dysenteriae cells don’t have any effect on the aptasensor selectivity. The aptasensor responses for S. dysenteriae detection were validated by real-time PCR. The results demonstrate that the fabricated aptasensor is as accurate as real-time PCR in target bacteria detection. The detection limit of real-time PCR for detection of S. dysenteriae was determined as 10 0 CFU mL -1 , whereas this value was obtained more than 10 CFU mL-1 for culturing method. The proposed aptasensor is a quick, low cost, ultrasensitive, and a specific sensor for detecting its target. Hence, it represents a valuable tool in food quality control. Unpasteurized and pasteurized skim milk, full fat milk and some water samples were contaminated with target bacterium and examined as real samples. Recovery studies indicated the good performance of the aptasensor in fatless real samples, but the aptasensor couldn’t be able to detect target bacterium in full fat milk. Due to the migration of milk fat golebules to the surface of the aptasensor and also disturbance in the target detecting, a pretreatment was taken to remove the maximum milk fat without sacrificing its microflora. Two different methods of cold extraction with organic solvents and centrifugal force were used to achieving this purpose. Organic solvents significantly decreased Shigella dysenteriae populations in the milk, so they were not good options. In the following, the central compound design was optimized by Surface Response Methodology for centrifuge time and force, and the results was confirmed by practical tests. The samples of full fat milk, well water, spring water, waste water and ground beef were evaluated by the aptasensor, and microbial contaminations of samples were confirmed by culturing method as well as polymerase chain reaction. Key Words Shigella dysenteriae PTCC1118 ; Gold nanoparticles, DNA-modified glassy carbon electrode, Electrochemical impedance spectroscopy, Cyclic voltammetry, Real-time PCR.

در این رساله، یک آپتا حسگر جدید و حساس مبتنی بر امپدانس الکتروشیمیایی برای باکتری شیگلا دیسانتری PTCC 1118 طراحی شد. برای ساخت آپتاحسگر، نانوذرات طلا به روش ترسیب الکتروشیمیایی روی الکترود کربن شیشه ای تثبیت شد. سپس، آپتامر تیول دار شده به صورت خودآرایی بر روی الکترود کربن شیشه ای اصلاح شده با نانوذرات طلا قرار گرفته و پس از آن نانوذرات آزاد موجود در سطح به وسیله ی ترکیب 6- مرکاپتو-1- هگزانول پوشش داده شدند. اندازه، شکل و توزیع نانوذرات طلا با میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شد. ردیابی باکتری شیگلا دیسانتری به‌وسیله ی افزایش مقاومت انتقال بار آپتاحسگر انجام شد و نیز میکروسکوپ نیروی اتمی جهت تایید این امر مورد استفاده قرار گرفت. برهمکنش بین آپتامر و پروتئین های غشای خارجی باکتری شیگلا دیسانتری باعث افزایش مقاومت انتقال بار می شوند. آپتاحسگر طراحی شده داری حد شناسایی 10 0 کلنی بر میلی لیتر بوده و نیز دامنه ی خطی 10 1 تا 10 6 کلنی بر میلی لیتر در کشت خالص باکتری شیگلا دیسانتری برای آن به دست آمد. انتخاب پذیری آپتاحسگر نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که آپتاحسگر طراحی شده، سلول های زنده ی باکتری شیگلا دیسانتری را از دیگر پاتوژن های مورد بررسی تشخیص می دهد. به علاوه، سلول های مرده ی باکتری شیگلا دیسانتری نمی توانند در انتخاب پذیری آپتاحسگر دخالتی داشته باشند. کارایی آپتاحسگر طراحی شده جهت ردیابی شیگلا دیسانتری به وسیله ی روش کشت میکروبی و واکنش زنجیره ای پلیمراز بر خط اعتبارسنجی شد. نتایج نشان می دهد که آپتاحسگر طراحی شده با دقتی مشابه روش واکنش زنجیره ای پلیمراز ردیابی باکتری هدف را انجام می دهد. حد تشخیص واکنش زنجیره ای پلیمراز بر خط جهت شناسایی باکتری شیگلا دیسانتری 10 0 کلنی بر میلی لیتر به دست آمد در حالیکه این مقدار در مورد روش کشت میکروبی بیش از 10 1 کلنی بر میلی لیتر می باشد. آپتاحسگر طراحی شده سریع، کم هزینه، بسیار حساس و در ردیابی گونه ی هدف دارای عملکرد انتخابی می باشد و از این‌رو می تواند به عنوان یک ابزار کنترل کیفیت غذایی مناسب پیشنهاد شود. شیر خام بدون چربی، شیر پاستوریزه بدون چربی، شیر پرچرب و چند نمونه آب به وسیله ی باکتری شیگلا دیسانتری آلوده شده و به عنوان نمونه های حقیقی مورد آزمون قرار گرفتند. مطالعات بازیابی، تاییدکننده ی عملکرد خوب آپتاحسگر در نمونه های حقیقی بدون چربی بود ولی آپتاحسگر طراحی شده نتوانست در نمونه های شیر پرچرب، شیگلا دیسانتری را ردیابی و شناسایی کند. با توجه به مهاجرت گلبول های چربی شیر به سطح آپتاحسگر و اختلال در ردیابی باکتری هدف، تصمیم گرفته شد پیش‌تیماری جهت حذف حداکثری چربی شیر با احتراز از آسیب به جمعیت میکروبی آن مورد مطالعه قرار گیرد. از بین روش های مختلف حذف چربی، دو روش استخراج سرد با حلال های آلی و روش استفاده از نیروی گریز از مرکز مورد بررسی قرار گرفت. سیستم های حلال آلی مورد استفاده، به جمعیت شیگلا دیسانتری در محیط شیر آسیب وارد کردند، بنابراین گزینه ی مناسبی برای این امر نبودند. نتایج مطالعات اولیه نشان داد که از میان روش های حذف چربی مورد مطالعه، استفاده از سانتریفوژ روش مناسب تری است. با استفاده از طرح مرکب مرکزی به وسیله ی روش سطح پاسخ، شرایط زمان و نیروی سانتریفوژ بهینه شده و به صورت عملی نیز تایید شد. چندین نمونه شیر پرچرب، آب چاه، آب چشمه، فاضلاب و گوشت چرخ کرده با آپتاحسگر مورد ارزیابی قرارگرفتند و نمونه های دارای آلودگی شیگلا دیسانتری به‌وسیله ی روش های کشت میکروبی و آزمون های بیوشیمیایی تکمیلی و همچنین واکنش زنجیره ای پلیمراز مورد بررسی نهایی قرار گرفتند. در نهایت، انجام این رساله توانست مسئله ی استفاده از آپتاحسگر بر مبنای امپدانس را برای ردیابی و ارزیابی کیفی مواد غذایی که می توانند منبع ورود شیگلا دیسانتری به بدن انسان باشد را حل کند. کلمات کلیدی: شیگلا دیسانتری PTCC 1118 ، نانو ذرات طلا، الکترود کربن شیشه ای اصلاح شده با DNA، امپدانس الکتروشیمیایی، ولتامتری چرخه ای، واکنش زنجیره ای پلیمراز بر خط.