SUPERVISOR
بدرالدین ابراهیم سیدطباطبایی (استاد راهنما) مجید طالبی (استاد مشاور) حجت هاشمی نسب علی آبادی (استاد مشاور)
STUDENT
Mohamadreza Karimi
محمدرضا کریمی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1395
TITLE
Micropropagation of pistachio’s rootstocks and evaluation of somaclonal variation in regenerated plants using SRAP markers
Pistachio ( Pistacia vera L.) is a member of Magnoliophyta division, dioecious, deciduous, living in the arid regions and wind-pollinated in Anacardiaceae family. Traditional techniques for propagation of pistachio are inadequate, time-consuming and low efficiency, consequently, new techniques of plant propagation for increase production efficiency and decrease cost must be used. Development of biotechnology methods such as plant tissue culture improved agricultural field in recently years. Tissue culture of pistachio began in the early 1980s and until now it has been suggested various culture media for growth and establishment. In-vitro propagation of this planthas some limitations such as inaccessibility of suitable explant with low contaminations, phenol exudation followed by explants died, low ratio of establishment, proliferation and rooting and finally shoot tip necrosis. The focus of thesis achieved a protocol for propagation of this plant and considering the integrity of genetic diversity of regenerated plants compared to native plants (somaclonal variation) using SRAP Markers. To disinfection of explant used different concentrations and times of sterilizing agent. In the next experiment, to counteract obstacle of phenol exudation in media culture before established the explant in medium, preparing immature explant in active seasons of the plants, added anti-oxidant in media culture, use of different concentrations of media and various amount of plant growth regulators and selected of height explant were considered. Proliferation rate using many types of media and plant growth regulators, changed the ferrous source, selected the appropriate explant from the establishment stage, use of adenine, peptone and silver nitrate in media culture. In rooting stage, change the concentration of media culture, replacement of plant growth regulator and use of activated charcoal was evaluated. Ten pair primers of SRAP used to evaluating of somaclonal variation. The results of this study showed that the best treatment for disinfection of 1-year explant that keeps in the greenhouse was 10% home detergent (with 5% Sodium hypochlorite) in 10 min., followed by ethanol 70% in 60 seconds and disinfection of stems that collects from the field was 20% home detergent (with 5% Sodium hypochlorite) in 10 min., followed by ethanol 70% in 120 seconds. The best seeds disinfection treatments were mercuric chloride with 0.1% in 10 mins. In proliferation stage use of DKW media culture with red ferrous sequestrene together with 3 milligrams per liter benzyl aminopurine and 0.3 milligrams per liter gibberellic acid with 100 milligrams per liter vitamin C was shown 8-10 rate of proliferating. Explant that had appropriate quality and size transfer to rooting media included ½ concentration of macro and micronutrients DKW media with 20 gram per liter sucrose and 2 milligrams per liter of indole-3-butyric acid for a week and after that subcultured to ½ macro and micro elements of DKW media culture without any plant growth regulator caused the emergence of roots. The results showed that regenerated plants were not significantly different from mother plants and somaclonal variation was low. It seems that because of using nods of stem caused their similarity was high.Using tissue culture-based biotechnology techniques to propagate and proliferate plants are highly efficient and commercially profitable. Key Words : Pistachio, UCB1, Mircopropagation, Tissue Culture, Somaclonal Variation, SRAP.
گیاه پسته با نام علمی Pistacia vera L.در ردهی گیاهان گلدار، دوپایه، خزانکننده و خشکزی که توسط باد گردهافشانی میکند و متعلق به خانواده آناکاردیاسه است. ازدیاد و تکثیر گیاه پسته بواسطه روشهای قدیمی ناکافی و زمانبر بوده و بازدهی مناسبی ندارد بنابراین اتخاذ روشهای نوین تکثیر و ازدیاد گیاهان امری اجتناب ناپذیر است که منجر به افزایش راندمان تولید و کاهش هزینهها میشود. توسعه روشهای بیوتکنولوژی از جمله کشت بافت گیاهی در سالهای اخیر پیشرفتهای زیادی را در زمینه کشاورزی موجب شده است. کشت بافت پسته در دهه 80 میلادی گزارش شده و تا امروز محیطهای کشت مختلفی برای استقرار و رشد آن گزارش شده است. تکثیر درون شیشهای این گیاه با محدودیتهایی مثل عدم دسترسی به ریزنمونهی مناسب و عاری از آلودگی، ترشح فنول و به دنبال آن مرگ گیاهچهها، ضریب پایین استقرار، پرآوری، ریشهزایی و سوختگی انتهایی همراه بوده است. در تحقیق حاضر به منظور دستیابی به پروتکل تکثیر این گیاه و با توجه به اهمیت حفظ یکپارچگی ژنتیکی گیاهان باززاشده نسبت به گیاهان مادری، تنوع سوماکلونال با نشانگر SRAP مورد بررسی قرار گرفت. جهت ضدعفونی ریزنمونهها، از مواد ضدعفونیکننده با غلظت و زمانهای متفاوت استفاده شد. همچنین جهت مقابله با مشکل ترشح فنول در محیط، قبل از کشت گیاهچهها در محیط توجه به تهیه ریزنمونههای جوانتر در فصول فعال گیاه و همچنین هنگام کشت افزودن آنتی اکسیدانتها به محیط کشت و کاربرد غلظت های مختلف محیط کشت و تنظیم کنندههای رشد و استفاده از گیاهچههای با طول بلندتر مد نظر قرار گرفت. در ادامه جهت بهبود پرآوری گیاهچهها انواع محیط کشت و هورمونها، تغییر منبع آهن، انتخاب ریزنمونهی مناسب از مرحله استقرار، استفاده از آدنین، پپتون و نیترات نقره آزمایش شد. در مرحلهی ریشهزایی تغییر غلظت محیط کشت، استفاده از زغال فعال و به کارگیری هورمون در مراحل مختلف مورد ارزیابی و پژوهش قرار گرفت. جهت بررسی تنوع سوماکلونال از 10 جفت آغازگر نشانگر SRAP استفاده شد. نتایج این تحقیق نشان داد بهترین تیمار جهت ضدعفونی نمونههای یک ساله که در گلخانه نگهداری شده بودند الکل 70 درصد به مدت 60 ثانیه و سپس استفاده از مادهی سفیدکنندهی خانگی (حاوی پنج درصد هیپوکلریت سدیم) به غلظت 10 درصد و مدت زمان 10 دقیقه و برای ضدعفونی ساقههای جمع آوری شده از محیطهای خارج گلخانه استفاده از الکل 70 درصد به مدت 100 ثانیه و سپس استفاده از مادهی سفیدکنندهی خانگی با غلظت 20 درصد به مدت 10 دقیقه مناسب تشخیص داده شد. بهترین تیمار ضدعفونی بذرها استفاده از کلرید جیوه با غلظت 1/0% و مدت زمان 10 دقیقه بود. در مرحله پرآوری استفاده از محیط کشت DKW با آهن قرمز سکسترون و ترکیب هورمونی سه میلی گرم در لیتر بنزیل آدنین و 3/0 میلی گرم در لیتر جیبرلیک اسید به همراه 100 میلی گرم در لیتر ویتامین C ضریب پرآوری هشت تا 10 نشان داد. گیاهچههای با کیفیت و اندازه مناسب جهت ریشهزایی در محیط DKW با یک دوم غلظت عناصر پرنیاز و کم نیاز و 20 گرم در لیتر ساکارز به همراه دو میلی گرم در لیتر هورمون ایندول بوتریک اسید، به مدت یک هفته و سپس انتقال گیاهچهها به محیط عاری از تنظیم کنندهی رشد DKW با نصف غلظت مواد پرنیاز و کم نیاز سبب ظهور ریشه شد. نتایج حاصل از بررسی تنوع نشان داد گیاهان باززاشده تفاوت چندانی با گیاهان مادری نداشته و میزان تنوع سوماکلونال در آنها کم است. به نظر میرسد به دلیل استفاده از ریزنمونه گره ساقه میزان شباهت در آنها بالا بود. استفاده از روشهای بیوتکنولوژی مبتنی بر کشت بافت به منظور تکثیر و ازدیاد گیاهان بسیار کارآمد و از لحاظ تجاری سودآور است. کلمات کلیدی : پسته - یو سی بی1- ریزازدیادی- کشت بافت- تنوع سوماکلونال- SRAP