Skip to main content
SUPERVISOR
Jahangir Khajehali,Masoud Bahar
جهانگیر خواجه علی (استاد مشاور) مسعود بهار (استاد راهنما)
 
STUDENT
Mahdis Hashemi Tameh
محدیث هاشمی طامه

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1389

TITLE

Molecular characterization of Phytoplasmas associated with apple and pear in Isfahan province
Phytoplasma caused diseases pose a potentially serious threat to the production of fruit trees worldwide and cause great losses of these products. In recent years, typical symptoms of phytoplasma induced disease on apple trees including witches’ broom, leaf stunting and abnormal growth of petioles and also rolling leaf, quick decline and slow decline of pears, have been observed in different areas of Isfahan province. To detect and justify; MARGIN: 0in 0in 5pt; mso-line-height-alt: .9pt; mso-layout-grid-align: none" dir=rtl Key words : Apple, Pear, Phytoplasma, Apple proliferation, Nested-PCR, PCR-RFLP, DNA sequencing
فایتوپلاسماها به عنوان یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده بیماری در روی درختان میوه در سراسر جهان گسترش زیادی داشته و خسارات فراوانی به این محصولات وارد می کنند. طی سال‌های اخیر در مناطقی از استان اصفهان علایم جاروک، تغییر شکل برگ و میوه‌ها، رشد گوشوارک‌ها و ضعف و کم رشدی در درختان سیب و لوله شدن برگ، قرمز شدن برگ‌ها و زوال و کم رشدی درختان گلابی مشاهده شد که با علایم بیماری‌های فایتوپلاسمایی شباهت داشت. به منظور شناسایی و گروه بندی فایتوپلاسماهای آلوده کننده درختان سیب وگلابی استان اصفهان، استخراج DNA از رگبرگ و دمبرگ نمونه‌های جمع آوری شده از درختان مشکوک صورت گرفت و برای ردیابی فایتوپلاسما از واکنش PCR با جفت آغازگر‌های عمومی ناحیه 16S rRNA فایتوپلاسمایی استفاده شد. در واکنش PCR دور اول برای ردیابی فایتوپلاسما در این نمونه‌ها، جفت آغازگر‌های P1/P7 و P1A/P7A استفاده شدند. با استفاده از آغازگر P1/P7 در تعداد محدودی از نمونه‌ها قطعه bp 1784 تکثیر شد و بقیه نمونه‌ها باندی تولید نکردند، ولی استفاده از آغازگر P1A/P7A منجر به تکثیر قطعه bp 1759 در تعداد بیشتری از نمونه‌ها شد. در ادامه کار، برای تکثیر نواحی مشخصی از قسمت داخلی ناحیه 16S-23S rRNA تکنیک Nested-PCR با استفاده از دو جفت آغازگر R16F2n/R16R2 و R16F1(X)/R16R1(X) به کار گرفته شد. استفاده از جفت آغازگر R16F2n/R16R2 در Nested-PCR بعد از PCR اول با جفت آغازگرهای P1/P7 و P1A/P7A منجر به تکثیر قطعه bp 1239 در تعداد زیادی از نمونه‌های جمع‌آوری شده در اواخر تابستان و اوایل پاییز شد، ولی تکثیر قطعه مورد نظر فایتوپلاسمایی در نمونه های بهاره و اوایل تابستان موفقیت آمیز نبود. ترکیب جفت آغازگر P1A/P7A به عنوان جفت آغازگر PCR دور اول و R16F2n/R16R2 در دور دوم بهترین روش ردیابی فایتوپلاسماهای سیب و گلابی ارزیابی گردید. با توجه به اهمیت گروه شاخه انبوهی سیب در بروز بیماری‌های فایتوپلاسمایی سیب و گلابی از جفت آغازگر R16F1(X)/R16R1(X) اختصاصی این گروه در واکنش Nested-PCR استفاده شد که قطعه bp 1100 در هیچکدام از نمونه‌های سیب آلوده به فایتوپلاسما مشاهده نگردید در حالی که این قطعه در نمونه‌های گلابی آلوده تکثیر شد. با توجه به عدم حضور فایتوپلاسماهای گروه شاخه انبوهی سیب، در سیب و به منظور شناسایی جدایه‌های عامل بیماری در سیب و گلابی جمع‌آوری شده، از آزمون PCR-RFLP جدایه‌ها استفاده شد. به این منظور یک قطعه bp 1239 از ناحیه داخلی ژن 16S rRNA فایتوپلاسمایی جدایه‌ها با استفاده از آغازگر R16F2n/R16R2 در واکنش Nested-PCR تکثیر شد و سپس این قطعه توسط آنزیم‌های برشی Rsa I , Hae III , Hpa II, Taq I و Hha I( Cfo I) مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. نتایج نشان داد که جدایه‌های فایتوپلاسمایی متنوعی در ایجاد بیماری فایتوپلاسمایی سیب و گلابی نقش دارند. بر اساس این آزمون، جدایه‌های سیب در دو گروه و جدایه‌های گلابی در چند گروه طبقه بندی شدند که تعدادی از آنها به عنوان نماینده برای تعیین توالی نوکلئوتیدی انتخاب گردیدند. مقایسه توالی‌های نوکلئوتیدی این جدایه‌ها با توالی‌های موجود در بانک ژن نشان داد که توالی جدایه‌های مورد مطالعه، 99%-100% با توالی فایتوپلاسمایی ثبت شده در بانک ژن جهانی (NCBI) مشابهت دارند. بررسی توالی‌های بدست آمده مشخص نمود که جدایه‌های فایتوپلاسمایی در سیب متعلق به دو گونه Candidatus . Phytoplasma. asteris و Ca. P. aurantifolia می باشند. گونه Ca. P. mali که در اروپا به عنوان مهمترین عامل فایتوپلاسمایی سیب شناخته شده است، در باغات سیب استان ردیابی نشد. از طرف دیگر، گونه Ca. P. pyri عامل اصلی بیماری زوال گلابی در باغات گلابی استان شناخته شد، هرچند تعدادی جدایه Ca . P. asteris و یک جدایه گونه Ca. P. prunorum عامل ایجاد بیماری زردی هسته دارها به عنوان فایتوپلاسماهای همراه گلابی در این تحقیق شناسایی شدند. با توجه به حضور گونه Ca. P. pyri در باغات گلابی می توان آن را به عنوان شایع‌ترین عامل فایتوپلاسمای گلابی معرفی کرد که در دنیا نیز مهمترین عامل بیماری زوال گلابی گزارش شده است. بر اساس توالی یابی ژن پروتئین ریبوزومی ( rp ) با استفاده از آغازگر rp (I)F1A/rp (I)R1A جدایه‌ها ی Aster yellows سیب وگلابی در زیر گروه rp -B قرار گرفتند. نتایج این تحقیق نشان داد، امکان همراهی فایتوپلاسماها از گروه‌های فایتوپلاسمایی مختلف در درختان سیب و گلابی وجود دارد که احتمالاً تغذیه یک ناقل مشترک در روی گیاهان یکساله و درختان سیب و گلابی سبب انتشار این عوامل بیماری زا می گردد. واژگان کلیدی : سیب، گلابی، فایتوپلاسما، گروه شاخه انبوهی سیب، آنالیز PCR-RFLP ، تعیین توالی نوکلئوتیدی

ارتقاء امنیت وب با وف بومی