خصوصیات مولکولی عامل بیماری کوتولگی زبر ذرت در استان اصفهان

STUDENT

DEGREE

YEAR

Maize ( Zea mays L.) is one of the most important plants in the family Poaceae. This plant affected by plant pathogens such as fungi, bacteria and viruses. Among maize pathogens, viruses play a more important role in infection and damaging to maize worldwide. Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) and Maize rough dwarf virus (MRDV) are two important viruses causing maize rough dwarf disease in worldwide. Infected maizes with these viruses show severe stunting, leaf darkening and enations on the abaxial surface of leaves. For detection and determination of molecular characteristics of causative agent of maize rough dwarf disease in Isfahan province, maize samples showing viral symptoms were collected during 2013-2014. Total RNA and dsRNA were extracted and used as template in RT-PCR. RT-PCR was performed using MRDV-F1/MRDV-R2, RBSDVs10F/RBSDVs10R and MRS6-1/MRS6-2 primer pairs. Amplification of the expected bands of 568 bp and 501 bp with MRDV-F1/MRDV-R2, RBSDVs10F/RBSDVs10R, respectively and no amplification with MRS6-1/MRS6-2 primer pair revealed samples were infected by RBSDV. The amplicons sequenced and BLAST search showed high homology of them with RBSDV isolates available at GenBank. Some samples were subjected to duplex one-step RT-PCR using RBSDVs10F/RBSDVs10R and AMLF/AMLR (specific primer pair for detection of Maize Iranian mosaic virus ) primer pairs, simultaneously. Results showed mixed infection of them to RBSDV and MIMV. After determining the RBSDV as causal agent of maize rough dwarf disease, segment 9 of RBSDV Iranian isolate (RBSDV-IR) was amplified. For this purpose, four primer pairs were designed and used in RT-PCR. The primer pairs RBSDS9F1full/RBSDS9R1full, S9full7f1/S9rRC4r1, S9rRC1f1/RBSDS9R1full and RBSDS9F1full/S9full4r1 were used and amplified 1900bp, 1000bp, 400bp and 300bp bands, respectively. All amplicons were sequenced. In addition, the 1900 bp band representing full length of S9 of RBSDV Iranian isolate was cloned and sequenced. All sequences were assembled to make a contig. A contig containing 1900 bp was generated and used in molecular comparisons. The BLAST search revealed this segment is full length of S9 segment of Iranian isolate RBSDV and containing two ORFs. Multiple alignment of nucleotide sequence of S9 of RBSDV Iranian isolate and those of other isolates available at GenBank showed high identity ranging from 89% – 85%. The highest (89%) and lowest (85.4%) identity were observed between Iranian isolate and RBSDV Zhejiang isolate (AJ297430) and MRDV Madrid isolate (JQ975000) from China and Spain, respectively. The phylogenetic analysis based on neighbor-joining method confirmed closest relationship of RBSDV Iranian isolate with RBSDV Zhejiang isolate from China. This study revealed that maize rough dwarf disease is probably caused by RBSDV in Isfahan province.

گیاه ذرت ( Zea mays L.) یکی از گیاهان بسیار مهم در تیره غلات محسوب می شود. این گیاه تحت تاثیر عوامل بیمارگر مانند ویروس ها، باکتری ها و قارچ ها قرار می گیرد. در میان بیمارگر های ذرت ویروس ها بیشترین نقش را در آلودگی و آسیب به آن ایفا می کنند. بیماری ویروسی کوتولگی زبر ذرت یکی از بیماری های مهم ذرت در دنیا و ایران می باشد که ویروس هایی چون ویروس کوتولگی زبر ذرت (MRDV) Maize rough dwarf viru s و ویروس کوتولگی رگه سیاه برنج Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) از عوامل مهم ایجاد کننده آن به شمار می روند. این ویروس ها علائمی از قبیل کوتولگی شدید، تیرگی برگ ها و زبری در قسمت پشت برگ ها را ایجاد می کنند. در ایران عامل این بیماری در ذرت (MRDV) Maize rough dwarf viru s گزارش شده است. به منظور ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس اصلی ایجاد کننده بیماری کوتولگی زبر ذرت، از مناطق ذرت کاری استان اصفهان طی سال های 93-92 نمونه برداری انجام شد. از نمونه های دارای علائم ویروسی آر ان ای کل و آر ان ای دو رشته ای استخراج شد و به عنوان رشته الگو در آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی MRDV-F1/MRDV-R2، RBSDVs10F/RBSDVs10R و MRS6-1/MRS6-2 جهت ردیابی ویروس مورد استفاده قرار گرفت. تکثیر قطعات مورد انتظار به ترتیب با اندازه های 568 و 501 و عدم تکثیر باند با آغازگر MRS6-1/MRS6-2 آلودگی نمونه ها به RBSDV را نشان داد. تعیین توالی باندهای تکثیرشده و مقایسه آن ها با نرم افزار BLASTn آلوده بودن نمونه ها را به RBSDV تایید نمود. همچنین تعدادی از نمونه ها به کمک روش duplex one-step RT-PCR و با جفت آغازگرهای RBSDVs10F/RBSDVs10R و AMLF/AMLR مربوط به ویروس موزاییک ایرانی ذرت (MIMV)، مورد ردیابی همزمان قرار گرفتند که نشان دهنده آلودگی تعدادی از نمونه ها به هر دو ویروس بود. پس از مشخص شدن RBSDV به عنوان ویروس بیمارگر بیماری کوتولگی زبر ذرت به منظور مطالعه دقیق تر خصوصیات مولکولی آن، اقدام به تکثیر کامل قطعه نه ژنومی این ویروس شد. از این رو طراحی آغازگرها جهت دست یابی به توالی کامل قطعه نه جدایه ایرانی RBSDV به کمک نرم افزارهای مولکولی انجام شد. جفت آغازگرهای طراحی شده مربوط به قطعه نه شامل RBSDS9F1full/RBSDS9R1full، S9full7f1/S9rRC4r1، S9rRC1f1/RBSDS9R1fullو RBSDS9F1full/S9full4r1 بودند که به ترتیب الگوهای bp1900، bp1000، bp400 و bp300 را تکثیرکردند. جهت تعیین توالی بهتر، قطعه تکثیرشده توسط جفت آغازگر RBSDS9F1full/RBSDS9R1full که برابر قطعه تمام طول شماره نه می باشد، همسانه سازی شد. همسانه بدست آمده به همراه محصولات PCR تکثیر شده توسط جفت آغازگرهای طراحی شده، تعیین توالی شدند. جهت به دست آمدن توالی کامل قطعه نه، مونتاژ تمامی توالی های حاصل منجر به تولید یک قطعه bp 1900 شد که مقایسه آن با توالی های موجود در GenBank نشان داد این توالی قطعه تمام طول شماره نه جدایه ایرانی ویروس کوتولگی رگه سیاه برنج و دارای دو ORF می باشد. همردیف سازی توالی کامل نوکلئوتیدی قطعه نه جدایه ایرانی RBSDV با تعدادی از توالی های موجود در بانک ژن، یکنواختی بالای آن را (85 % تا 89%) با توالی سایر جدایه های RBSDV گزارش شده از سایر نقاط دنیا نشان داد. بیشترین درصد یکنواختی توالی کامل نوکلئوتیدی به میزان 89% با جدایه (AJ297430) Zhejiang ویروس RBSDV از چین و کمترین میزان (3/85 %) مربوط به جدایه مادرید (JQ975000) ویروس MRDV بود. ارتباط نزدیکتر جدایه ایرانی به RBSDV با رسم درخت تبارزایی بر اساس توالی کامل نوکلئوتیدی قطعه نه تایید شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که عامل بیماری کوتولگی زبر ذرت در استان اصفهان به احتمال زیاد ویروس کوتولگی رگه سیاه برنج می باشد.