شناسایی محصولات کشاورزی تراریخته با استفاده از روشهای مبتنی بر PCR

STUDENT

DEGREE

YEAR

Genetically modified (GM) plants are one of the great achievements of modern biotechnology in agriculture. They, in recent years, have conquered the global food market insofar as the land under the cultivation of them and the number of farmers who cultivate these crops have been constantly increasing. However, there is still not a widespread use of this type of agricultural production and even the distribution of genetically modified (GM) crops is banned in some countries. Therefore, due to the global trade of GM products, the customs rules of these countries require that imported products should be iected for the presence of additional genes. Such iections require the use of appropriate methods to determine the presence of GM genes in agricultural production. According to international biosafety law, the import of genetically modified plants without the permission of Biosafety Committee into the country is prohibited, but since some products are not imported into the country through customs ports, identification between GM/non-GM products has a great importance especially in the consumer market products. This study was carried out to detect genetically modified crops in the markets of Iran using PCR based methods. In this study, samples of crops, including tomato, rice, soybean, corn, canola and cotton were collected from various sources such as shops, greenhouses, livestock and poultry factories and farms in Isfahan. The initial screening of all samples was performed using primer pairs P35S F/R for CaMV35S promoter and NOS-1/NOS-3 for NOS terminator. DNA samples of tomato, soybean, canola, cotton and corn amplified 195 bp and 180 bp a part of 35S promoter and NOS terminator sequence, respectively. The sequence of fragments verified by comparison with known sequences in GeneBank and indicated a 100% homology. In rice samples, it was not observed any band indicating the presence of NOS terminator and 35S promoter region. Finally, GMO specific primers were used for the selective detection and identification of selected transgenic plants. Therefore, the tomato samples were tested for the presence of antisence olygalactoronase gene by means of the primer pair PG F/R which generate an amplicon 384bp in all samples that had 35S romoter or NOS terminator band or both, with 100% similarity in GeneBank database related sequenced. Amplification of 498 bp in cotton, canola and soybean samples by means of the primer pair CP4-E F/R and its high homology (99%) with the sequence of 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosohate synthase gene, confirmed the presence of CP4-E gene in these crops. In order to identify GM corns, Cry1A(b)F/R were used to detect endotoxin cry gene and all of corn samples generated an amplicon 322bp in length by 100% similarity with sequences of Cry1A(b) in GeneBank database. In the present study, rice samples did not generate any band using the tested primers. The results of this study showed that the GM crops are available in Iranian markets without consumers’ awareness. Keywords: Iran, GM crops, PCR, Detection

گیاهان تراریخته یکی از دستاوردهای مهم بیوتکنولوژی نوین در زمینه کشاورزی هستندکه در سال های اخیر بخشی از بازارهای غذایی دنیا را تسخیر نموده اند و به طور مداوم بر سطح زیر کشت این گیاهان و همچنین تعداد کشاورزانی که به کشت این محصولات می پردازند، افزوده می شود. با این وجود، هنوز استفاده از این نوع محصولات کشاورزی فراگیر نشده و عرضه محصولات تراریخته در برخی کشورها ممنوع می باشد. بنابراین، به دلیل جهانی شدن تجارت محصولات تراریخته، مقررات این نوع کشورها ایجاب می کند که محصولات وارداتی از نظر تراریختگی ژنتیکی بازرسی شوند. چنین بررسی هایی نیازمند به کارگیری روش های مناسب جهت تعیین حضور ژن های تراریخته در تولیدات کشاورزی می باشد. طبق قانون بین المللی ایمنی زیستی، واردات گیاهان تراریخته بدون مجوز کمیته ایمنی زیستی به داخل کشور ممنوع است، ولی چون بعضی از محصولات وارداتی به کشور از مبادی گمرکی وارد نشده وکنترل نمی شوند؛ لذا باید تراریخته بودن یا نبودن آنها، بخصوص فرآورده های موجود در بازار مصرف را مورد ارزیابی قرار داد. در این پژوهش تلاش شد تا محصولات تراریخته احتمالی موجود در بازار ایران، بر اساس روش های مرسوم مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) بررسی شوند. در مطالعه حاضر، نمونه هایی از محصولات کشاورزی شامل گوجه فرنگی، برنج، سویا، ذرت، کلزا و پنبه از منابع مختلف مانند فروشگاه ها، گلخانه ها، کارخانجات خوراک دام و طیور و دامپروری های بزرگ در سطح استان اصفهان جمع آوری شد تا به ظن تراریخته بودن، حضور ژن های ادغام شده خارجی در آنها ارزیابی شود . ابتدا با استفاده از آغازگرهای عمومیP35S F/R وNOS-1/NOS-3 که به ترتیب برای شناسایی پروموتور CaMV35Sو خاتمه دهنده NOS مورد استفاده قرار می گیرند، ماهیت تراریختگی این محصولات بررسی شد. در این پژوهش، نمونه های گوجه فرنگی، سویا، کلزا، پنبه و ذرت قطعات نوکلئوتیدی 195، مربوط به قسمتی از توالی پروموتور P35S و bp 180مربوط به قسمتی از خاتمه دهنده NOS را تکثیر نمودند. همولوژی %100توالی نوکلئوتیدی این قطعات در مقایسه با نمونه های موجود در بانک ژنی تأیید نمودکه محصولات مورد بررسی به لحاظ ژنتیکی دست ورزی شده اند. در این آزمایشات هیچکدام از نمونه های برنج وارداتی قطعات مورد نظر را تکثیر ننمودند. برای شناسایی نوع ژن اضافه شده به این محصولات ترا ریخته، از آغازگرهای اختصاصی استفاده گردید. به منظور شناسایی گیاهان گوجه فرنگی تراریخته، جفت آغازگرPG F/R ، اختصاصی برای تکثیر آنتی سنس ژن پلی گالاکتوروناز، به کار رفت. تمام نمونه هایی که باند مربوط به پروموتورP35S یا خاتمه دهنده NOSیا هر دو را داشتند، باندbp 384 مربوط به قسمتی از آنتی سنس ژن PG را تکثیر نمودند که پس از توالی یابی و همردیف سازی، شباهت %100 این قطعه با بخشی از توالی ثبت شده ژن مزبور در بانک ژن محرز شد. با تکثیر یک باند 498 نوکلئوتیدی در نمونه های پنبه، کلزا و سویا ، طی استفاده از جفت آغازگر CP4-E F/R ، وجود ژن 5- انول پیروویل شیکیمات-3- فسفات سنتاز در آنها مورد تأیید قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی این قطعه با توالی قسمتی از ژن مزبور همولوگی 99% داشت. در شناسایی گیاهان ذرت تراریخته، از جفت آغازگرCry1A(b)F/R که برای تکثیر قسمتی از ژن اندوتوکسین Cry طراحی شده است، استفاده گردید و تمام نمونه های ذرت مورد بررسی، باندbp322 مورد نظر را تولید نمودند. توالی نوکلئوتیدی این قطعه ژنی نیز، با بخشی از ژن اندوتوکسین Cry شباهت %100 داشت. نتایج حاصل، تراریخته بودن نمونه های سویا، کلزا، پنبه و ذرت مورد بررسی را تایید نمود. در پژوهش حاضر، نمونه های برنج جمع آوری شده با هیچکدام از جفت آغاز گرهای مورد استفاده باندی تولید نکردند و به این ترتیب تراریخته بودن نمونه های برنج وارداتی تأیید نشد. نتایج این تحقیق نشان داد که محصولات تراریخته در بازار ایران وجود دارند، بدون آنکه مصرف کنندگان از ماهیت تغییر یافته آنها اطلاع داشته باشند. واژگان کلیدی : محصولات تراریخته، PCR ، شناسایی، ایران