SUPERVISOR
Mohammad.J. Taherzadeh,Keikhosro Karimi
محمدجعفر طاهرزاده اصفهانی (استاد مشاور) کیخسرو کریمی (استاد راهنما)
STUDENT
Behzad Satari Baboukani
بهزاد ستاری بابوکانی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده مهندسی شیمی
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1390
TITLE
Pretreatment of lignocellulosic materials and fermentation by zygomycetes fungi
Mucor indicus is a dimorphic fungus capable of producing ethanol from lignocellulosic materials with numerous advantages compared to Saccharomyces cerevisiae . Moreover, the biomass of this fungus contains valuable chemicals, i.e. , lipid, protein, and chitosan. Production of these valuable chemicals can improve the economy of cellulosic ethanol. The present study is aiming at the production of ethanol as well as fungal biomass from different lignocelluloses. In order to effectively release the monomeric sugars from lignocelluloses by cellulases, a pretreatment process is required before enzymatic hydrolysis. Pretreatment with cellulose solvent, phosphoric acid and NMMO, on pinewood, elmwood, and rice straw, and a simultaneous pectin extraction and pretreatment on citrus waste were performed. The citrus waste extractable sugars (CWES) were also extracted and used as a carbon- and nutrients-rich medium for fungal cultivation. Phosphoric acid pretreatment enhanced the enzymatic hydrolysis yield and especially the initial hydrolysis rate. Effects of the fungal morphology on the major metabolites, i.e. , ethanol and biomass ingredients (fatty acids and chitosan), were investigated. Purely yeast-like form resulted in 78–92% of the maximum theoretical ethanol yield with 0.43–0.64 gL ?1 h ?1 productivity, whereas fermentation by purely filamentous form resulted in the yield and productivity of 48–66% and 0.3–0.4 gL ?1 h ?1 , respectively. Beside ethanol, the fungus produced a large amount of chitin-chitosan (62–67% of the fungal alkali insoluble materials) in filamentous form, while the value was 41–45% for yeast-like form. Furthermore, yeast-like cells produced nutritionally valuable fatty acids at a rate higher than that by filamentous form (3.7 and 2.7%, respectively). Linoleic acid, a polyunsaturated omega-6, was the dominant fatty acid available in the biomass for both morphologies. The fermentation products were significantly dependent on the fungus morphology but not on the lignocellulose type. Yeast-like cells exhibited better performance in ethanol and oil production, whereas the filamentous cells produced higher amounts of chitosan. NMMO pretreatment enhanced the maximum cellulase adsorption capacity and strength of binding of the lignocelluloses. Besides, crystalinity index (CI) reduced after the pretreatment for all the lignocelluloses. The highest decrease in CI and increase in the adsorption capacity were observed for rice straw, in which CI reduced from 73 to 21% and cellulase adsorption capacity increased from 65 to 99 mg cellulase per gram substrate. Glucan content was not considerably changed after pretreatment. Furthermore, SEM images showed increase in the porosity or enzyme accessibility of the biomass cell wall for all the samples after pretreatment. Cultivation of M. indicus and R. oryzae on CWES in a 4-L airlift bioreactor resulted in consumption of almost all the sugars and production of 250 and 280 g fungal biomass per kg of consumed sugar, respectively. These biomasses correspondingly contained 40 and 51% protein and 9.8 and 4.4% oil. Furthermore, the cell walls of the fungi were rich in chitin and chitosan; 0.61 and 0.69 g/g cell wall for M. indicus and Rhizopus oryzae , respectively. Moreover, M. indicus grew as clump mycelia in the airlift bioreactor, while R. oryzae formed spherical suspended pellets during the course of cultivation, which is a promising feature towards industrialization of the process. A process for simultaneous pectin extraction and pretreatment of the lignocellulose citrus wastes with a factorial design for three variables temperature, pH, and extraction time was performed. The maximum pectin yield of 45.5% on extractive-free CW obtained at pH 1.8, time 2 h, and temperature 80 ?C. Glucose yields in enzymatic hydrolysis of pectin-free CW were also reported higher at pH 1.8. An optimization approach for pectin extraction and pretreatment aiming at maximizing sum of pectin extraction yield and glucose liberation during enzymatic hydrolysis was done. The optimum experiment was process variables of pH 1.8, time 2 h. Fermentation of enzymatic hydrolysates by the zygomycetes M. indicus yielded fungal biomass of at least 355 mg biomass per gram consumed sugar. Keywords Chitosan, Crystalinity index, Dimorphic, Enzymatic hydrolysis, Enzyme adsorption, Ethanol, Mucor indicus , Pectin, Pretreatment, Rhizopus oryza .
موکورایندیکوس یک قارچ دوریختی است که توانایی تولید اتانول از مواد لیگنوسلولزی با مزایای زیادی نسبت به ساکرومایسس سرویزیه را دارد. به علاوه، بیومس این قارچ حاوی ترکیبات ارزشمندی مانند لیپید، پروتئین و کیتوزان است. تولید این مواد باارزش میتواند به بهبود اقتصادی تولید اتانول سلولزی کمک کند. هدف این رساله تولید اتانول و بیومس باارزش قارچ از ترکیبات لیگنوسلولزی مختلف بود. برای آزاد شدن موثر قندهای موجود در ترکیبات لیگنوسلولزی با استفاده از آنزیم های سلولاز، یک مرحله پیشفرآوری قبل از هیدرولیز آنزیمی ضروری است. پیشفرآوری توسط حلال های سلولز (فسفریک اسید و NMMO) بر روی چوب کاج، نارون و کاه برنج و یک پیشفرآوری نوین همزمان با استخراج پکتین بر روی ضایعات مرکبات صورت گرفت. قندهای آزاد موجود در ضایعات مرکبات نیز استخراج و به عنوان منبع غنی از کربن و مواد مغذی برای رشد قارچ استفاده شد. پیشفرآوری فسفریک اسید باعث افزایش بازده هیدرولیز آنزیمی و مخصوصاً نرخ اولیه هیدرولیز شد. تاثیر مورفولوژی قارچ بر روی متابولیتهای مختلف مانند اتانول، اسیدهای چرب و کیتوزان مورد مطالعه قرار گرفت. قارچ با مورفولوژی کاملاً مخمری بازده اتانول 92-87 درصد و نرخ تولید 64/0-43/0 گرم بر لیتر بر ساعت را تولید کرد. این در حالی است که مورفولوژی کاملا رشته ای بازده اتانول 66-48 درصد با نرخ تولید 4/0-3/0 گرم بر لیتر بر ساعت را به دست داد. علاوه بر اتانول، بیومس قارچ مقدار زیادی کیتین-کیتوزان (67-62 درصد AIM) در مورفولوژی رشتهای و 45-41 درصد در مورفولوژی مخمری را تولید کرد. به علاوه، سلولهای مخمری شکل مقادیر بالاتری از اسیدهای چرب را نسبت به سلولهای رشتهای تولید کردند (به ترتیب 7/3 و 7/2 درصد). لینولئیک اسید، اسید چرب غالب در بیومس قارچ بود. تفاوت در مقدار محصولات تخمیر به دست آمده وابسته به مورفولوژی قارچ و غیروابسته به نوع ماده لیگنوسلولزی بودند. قارچ با مورفولوژی مخمری کارایی بهتری در تولید اتانول و لیپید و قارچ با مورفولوژی رشتهای راندمان بهتری در تولید کیتوزان از خود نشان دادند. پیشفرآوری با NMMO نیز باعث بهبود در قابلیت جذب آنزیم و قدرت جذب در مواد لیگنوسلولزی شد. همچنین ضریب بلورینگی پس از پیشفرآوری برای کلیه مواد لیگنوسلولزی کاهش یافت. بیشترین کاهش در ضریب بلورینگی و افزایش در قدرت جذب مربوط به کاه برنج بود که ضریب بلورینگی از 73 به 21 درصد کاهش و قدرت جذب آنزیم سلولاز از 65 به 99 میلیگرم آنزیم بر گرم سوبسترا افزایش یافت. درصد گلوگان در کلیه نمونهها دستخوش تغییر چندانی نشد. همچنین تصاویر SEMنشان داد که تخلخل نمونهها پس از پیشفرآوری افزایش یافته است. تخمیر قارچ بر روی ترکیبات قابل استخراج با آب ضایعات مرکبات در یک بیوراکتور هوابالابر با نرخ هوادهی 5/3 استاندارد لیتر بر دقیقه منجر به مصرف تقریبا کلیه قندهای موجود در محیط در عدم حضور مواد مغذی و تولید به ترتیب 68/4 و 03/4 گرم بر لیتر بیومس قارچ با 40 و 51 درصد پروتئین برای موکورایندیکوس و رایزوپوس اورایزه شد. علاوه بر پروتئین، بیومس قارچ به دست آمده از بیوراکتور به ترتیب برای موکورایندیکوس و رایزوپوس اورایزه حاوی 8/9 و 4/4 درصد روغن است. به علاوه، دیواره سلولی قارچها منبعی غنی از کیتوزان است (به ترتیب 61/0 و 69/0 گرم بر گرم دیواره سلول برای موکورایندیکوس و رایزوپوس اورایزه). اگر چه موکورایندیکوس به صورت رشتهای پراکنده در بیوراکتور رشد کرد، رایزوپوس اورایزه به صورت گویچههای کروی رشد کرد که این مورفولوژی میتواند کاربردهای صنعتی این قارچ را بهبود بخشد. در ادامه، یک فرآیند همزمان استخراج پکتین و پیشفرآوری بر روی ضایعات مرکبات با یک طراحی آزمایش با سه پارامتر دما، pH و زمان انجام شد. بیشینه بازده پکتین برابر با 5/45 درصد بر مبنای ضایعات بدون مواد قابل استخراج در pH برابر 8/1، زمان 2 ساعت و دمای 80 درجه سلسیوس بدست آمد. بازده گلوکز بدست آمده از هیدرولیز آنزیمی مواد فرآوری شده نیز برای آزمایشهای که در pH برابر 8/1 انجام گرفته بود، به طور قابل توجهی از دیگر آزمایشها بیشتر بود. یک فرآیند بهینه سازی بر مبنای بیشینه کردن بازده پکتین و گلوکز به دست آمده از هیدرولیز آنزیمی انجام گرفت. شرایط بهینه، دمای 80 درجه سلسیوس، زمان 2 ساعت و pH برابر با 8/1 بود. تخمیر مایع به دست آمده از هیدرولیز آنزیمی با قارچ موکورایندیکوس حداقل 355 میلیگرم بیومس قارچ بر گرم قند مصرفی را تولید نمود. کلمات کلیدی: 1- اتانول 2-پکتین 3- پیشفرآوری 4-جذب آنزیم 5- دوریختی 6- قارچ رایزوپوس اورایزه 7- قارچ موکورایندیکوس 8-بلورینگی 9- کیتوزان 10- هیدرولیز آنزیمی