تشخیص همزمان ویروس های مهم سیب زمینی با استفاده از روش Multiplex RT-PCR

STUDENT

DEGREE

YEAR

Potato ( Solanum tuberosum L.), is economically and nutritionally the fifth most important crop after wheat, rice, maize and barley. Virus diseases are the most important destructive agents in potato worldwide. Potato virus Y (PVY), Potato leaf roll virus (PLRV), Potato virus S (PVS) and Alfalfa mosaic virus (AMV) cause great yield losses in potato. Isfahan and Chaharmahal-o- bakhtiari provinces are the major areas in potato production in Iran and mentioned viruses are widely spread in these areas .So far, different methods have been developed for detection of potato viruses, but polymerase chain reaction (PCR) as a sensitive, rapid and easy method is increasingly used more than other methods in detection of potato viruses.The unique feature of this method is the simultaneous detection of several viruses (multiplex RT-PCR) which makes reduce detection costs and time. Regarding importance of virus infection in potato fields in Isfahan and Chaharmahal-o- bakhtiari provinces and requiring a rapid and sensitive detection method for producing virus-free potato seed tubers, designing and optimizing of a multiplex RT-PCR method for simultaneous detection of important potato viruses seems to be an essential need of research plant pathology laboratories and plant disease clinics. For this purpose, samples showing viral symptoms including mosaic, leaf rolling and bright yellow spots (calico) were collected from Isfahan, Chadegan, Daran, Damaneh, Frieden in Isfahan province and Broujen and Faradonbeh in Chaharmahal-o- bakhtiari province. In addition, several samples available in greenhouse of Isfahan University of technology were used. Total RNA was extracted from leaf samples according to lithium chloride method. cDNA synthesis and PCR were performed for detection of PVY, PVS, PLRV, AMV using specific primer pairs PVYCPcEcoRII/PVYCPvBamHI, PLRV-fkhR/PLRV-fkhF, PVS-R/PVS-F, AMV-R/AMV-F, respectively. In addition primer pair 18s rRNA-R/18s rRNA-F was used as internal control gene. The PCR was done using primer pairs individually, binary combination of each primer pairs and primer pairs of all four viruses. Duplex and multiplex RT-PCR were optimized with changes in primer concentration, magnesium chloride concentration and primers annealing temperature. Simultaneous detection of PVY, PVS, PLRV and AMV was performed as duplex RT-PCR with binary combination of each primer pairs and then multiplex RT-PCR with all four primer pairs. In PCR, duplex and multiplex RT-PCR, primer pairs PVYCPcEcoRII / PVYCPvBamHI, PVS-R/PVS-F, AM-R/AMV-f, PLRV-fkhR/PLRV-fkhR and 18s rRNA -R / 18s rRNA-F amplified 801bp, 684bp, 415bp, 336bp and 255bp segments, respectively. It seems that the optimized multiplex RT-PCR in this study as a sensitive, accurate and rapid method could be used in simultaneous detection of important potato viruses. Keywords : multiplex RT-PCR, Potato virus Y, Potato leaf roll virus, Potato virus S and Alfalfa mosaic virus, 18s rRNA gene

سیب زمینی با نام علمی ( Solanum tuberosum L.)، از نظر اهمیت غذایی و اقتصادی بعد از محصولاتی چون گندم، برنج، ذرت و جو در رتبه پنجم قرار دارد. بیماری های ویروسی از مهم ترین عوامل خسارت زای سیب زمینی در جهان و ایران محسوب می شوند. ویروس های آلوده کننده سیب زمینی از جمله ویروس وای سیب زمینی، پیچیدگی برگ سیب زمینی ، اس سیب زمینی و موزاییک یونجه در مناطق مهم سیب زمینی کاری دنیا، خسارات شدید اقتصادی را وارد می کنند. استان اصفهان و چهار محال و بختیاری از مناطق عمده کشت سیب زمینی در ایران به شمار می روند و ویروس های مزبور در این مزارع شیوع گسترده ای دارند. هر چند تاکنون روش های مختلفی برای تشخیص عوامل ویروسی سیب زمینی ارائه شده است، ولی امروزه روش واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) به عنوان روشی حساس، سریع و آسان کارایی بسیار بالایی در تشخیص این ویروس ها دارد. ویژگی منحصر به فرد این روش در تشخیص همزمان چند ویروس(multiplex RT-PCR) باعث کاهش هزینه ها و زمان آزمایش می گردد. با توجه به بالا بودن میزان آلودگی مزارع سیب زمینی به ویروس در ایران و نیاز کشور به تولید غده های بذری سالم و عاری از ویروس ها، طراحی و بهینه سازی multiplex RT-PCR جهت ردیابی همزمان ویروس های مهم سیب زمینی از نیازهای ضروری آزمایشگاه های تحقیقاتی و کلینیک های تشخیص بیمار ی های گیاهی می باشد. به این منظور، در این تحقیق ردیابی همزمان PVY، PVS، PLRV و AMV از غده های سیب زمینی مزارع اصفهان و چهارمحال و بختیاری به روش multiplex RT-PCR مورد توجه قرار گرفت. نمونه برداری از مناطق سیب زمینی کاری استان اصفهان )چادگان، داران، دامنه، فریدن و فریدون شهر( و در استان چهارمحال و بختیاری )بروجن و فرادنبه( از بوته های سیب زمینی واجد علایم ویروسی موزاییک، پیچیدگی برگ ، راست ایستادن بوته و لکه های زرد روشن(Calico) انجام گرفت. همچنین از نمونه های موجود در گلخانه دانشگاه صنعتی اصفهان نیز استفاده شد. استخراجTotal RNA هر یک از نمونه ها به طور جداگانه از برگ گیاهان دارای علایم ویروسی طبق روش کانونتاپیپت و همکاران انجام شد. ساخت cDNA و انجام واکنش PCR به کمک آغازگرهای هر ویروس به صورت جداگانه، ترکیب دوتایی و مخلوط هر چهار ویروس انجام شد. بهینه سازی واکنش multiplex RT-PCR با اعمال تغییرات در غلطت آغازگرها، کلرید منیزیم و دمای اتصال آغازگر ها انجام شد. ردیابی همزمان PVY، PVS، PLRV و AMV همراه با 18s rRNA به عنوان کنترل داخلی ابتدا با استفاده از روش duplex RT-PCR به صورت دو به دو سپس با استفاده از روش multiplex RT-PCR به صورت چهارتایی با استفاده از جفت آغازگرهای (PVYCPc Eco RII/PVYCPv Bam HI، PLRV-fkhR/PLRV-fkhF، PVS-R/PVS-F و AMV-R/AMV-F) و آغازگر 18s rRNA-R/18s rRNA-F به عنوان کنترل داخلی به طور همزمان انجام شد. نتایج نشان داد که جفت آغازگر VYCPc Eco RII/PVYCPv Bam HIباند bp801، جفت آغازگر PVS-R/PVS-F باند bp684، جفت آغازگر AMV-R/AMV-Fباند bp415، جفت آغازگر PLRV-fkhR/PLRV-fkhF باندbp 336 و جفت آغازگر 18s rRNA-R/18s rRNA-F باند bp 255 را به عنوان کنترل داخلی تکثیر کردند. همچنین با بهینه سازی و انجام تغییرات در مقدار غلظت کلرید منیزیم، آغازگرها، زمان گسترش و دمای اتصال آغازگرها، چهار ویروس PVY، VS، PLRV و AMV به همراه 18s rRNA با موفقیت ردیابی شدند. به این ترتیب معلوم شد که می توان از روش بهینه سازی شده multiplex RT-PCR به عنوان روشی حساس، دقیق، سریع و قابل اعتماد در ردیابی همزمان ویروس های مهم سیب زمینی استفاده نمود. کلمات کلیدی : سیب زمینی، multiplex RT-PCR، ویروس وای سیب زمینی، ویروس اس سیب زمینی، ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی و ویروس موزاییک یونجه