موتاسیون‌زایی هدایت‌شده در توالی تیوردوکسین نوعTrx h) h ) از گیاه برنج و اثرآن بر فعالیت کینتیکی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous, low-molecular-mass proteins that are characterized by the presence of an exposed active site with the amino acid sequence of WC(G/P)PC. Trxs participate in numerous redox processes via the reversible disulfide/dithiol reduction reaction involving active site cysteines. Plants have multiple isoforms of Trx as opposed to animals, bacteria, fungi. The multiple Trx isoforms in plants are 0in 0in 0pt -0.3pt" Key words: Thioredoxin, active site, site- directed mutagenesis, pH stability, dimerize

تیوردوکسین‌ها (Trxs) پروتئین‌هایی با وزن مولکولی کم هستند که با توالی آمینواسیدی WC(G/P)PC در جایگاه فعال قابل تشخیص می‌‌باشند. Trx‌‌ها با کمک سیستئین‌های جایگاه فعال و از طریق احیای برگشت‌پذیر باند‌های دی‌سولفیدی در فرآیند‌های متعدد اکسیداسیون- احیا شرکت می‌کنند. برخلاف پستانداران، باکتری‌ها و قارچ‌ها، گیاهان دارای ایزوفرم‌های مختلفی از Trx می‌باشند. ایزوفرم‌های مختلف Trx در گیاهان بر اساس ساختار اولیه و مکان قرارگیری در سلول دسته‌بندی می‌شوند. تیوردوکسین‌های f، m، x و y در کلروپلاست ، Trxo در میتوکندری و ایزوفرم‌های Trxh در چندین اندامک سلولی واقع شده‌اند. در گیاهان عالی ایزوفرم‌های متعددی از Trxh وجود دارند. در ژنوم برنج ( Oryza sativa )، نه ژن کدکننده‌ی Trxh شناسایی شده‌است. همردیف‌سازی‌ چندگانه بین این ایزوفرم‌ها، تفاوت قابل توجهی بین ایزوفرم OsTrx20 و هشت ایزوفرم دیگر نشان داد. توالی جایگاه فعال این هشت ایزوفرم از موتیف عمومی جایگاه فعال Trxها (WCG/PPC) تبعیت می‌کند در حالی‌که در جایگاه فعال OsTrx20 آمینواسید Gly/Pro با Thr جایگزین شده است. به علاوه در نزدیکی جایگاه فعال، در دیگر ایزوفرم‌های Trxh، آمینواسید حفاظت‌شده‌ی Asp حضور دارد که در OsTrx20 با آمینواسید بازی Lys جایگزین شده است. درتحقیق حاضر، برای مطالعه‌ی نقش حیاتی آمینواسید‌های حفاظت‌شده‌ی Gly و Asp در فعالیت احیایی Trxh، با استفاده از روش موتاسیون‌زایی هدایت‌شده Thr 55 و Lys 48 به ترتیب با Gly و Asp در OsTrx20 و Gly 41 با Thr در OsTrx23 جایگزین شدند. به این منظور و بر اساس این روش واکنش PCR با استفاده از ناقل pET-15b حاوی ژن کدکننده‌ی OsTrx20 طبیعی- به عنوان ماده‌ی اولیه‌ی ژنتیکی- انجام شد. محصول PCR بعد از تیمار با آنزیم Dpn I به باکتری Ecoli سویه‌ی DH5? منتقل شد. بعد از تأیید موتاسیون‌زایی با استفاده از توالی‌یابی و هضم آنزیمی به کمک آنزیم برشی مناسب، پلاسمید‌های حاوی ژن جهش‌یافته‌ به باکتری E.coli سویه‌ی Rosetta (DE3) انتقال داده شدند. پروتئین‌های جهش‌یافته‌ی نوترکیب OsTrx20 (T55G) ، OsTrx20 (K48D) ، OsTrx20 (T55G)(K48D) و His6-OsTrx23 (G41T) پس از القای IPTG در فاز محلول تولید شدند. پروتئین‌های نوترکیب موجود در فاز رویی به روش کروماتوگرافی جذبی و با استفاده از ستون‌های His-Trap خالص‌سازی شدند. ایزوفرم‌های Trxh جهش‌یافته‌ی نوترکیب نیز مانند پروتئین طبیعی از نظر توانایی احیای انسولین- سوبسترای عمومی Trx - درpHهای مختلف بررسی شدند. به علاوه قابلیت احیای جهش‌یافته‌ها توسط OsNTR1 آزمایش و با پروتئین طبیعی مقایسه شد. نتایج نشان داد که فعالیت OsTrx20 (Wt) در پاسخ به تغییرات pH پایدار نبوده در حالی‌که جهش‌یافته‌های OsTrx20 (T55G) ، OsTrx20 (K48D) و OsTrx20 (T55G)(K48D) در برابر این تغییرات پایدار بودند. مطابق با این، جایگزینی Gly 41 با Thr در ایزوفرم OsTrx23، منجر به از دست رفتن پایداری OsTrx23 در pHهای مختلف شد. به علاوه نتایج نشان داد که جایگزینی Thr 55 با Gly و Lys 48 با Asp، تاحدودی باعث بهبود برهم‌کنش OsNTR1 و OsTrx20 شد. بر این اساس برهم‌کنش OsNTR1 و OsTrx23 نیز با جایگزینی Gly 41 با Thr به مقدار قابل ملاحظه‌ای کاهش پیدا کرد. به منظور مطالعه‌ی نقش Cysهای انتهای آمینو در OsTrx20 و OsTrx23، هرکدام از Cysها با Ser به روش موتاسیون‌زایی هدایت‌شده جایگزین شد. نتایج نشان داد درحالی‌که پروتئین‌های OsTrx20 (Wt) و OsTrx23 (Wt) به صورت مخلوطی از فرم مونومر و دایمر حضور دارند، جهش‌یافته‌ها‌ی OsTrx20 (C3S)(C4S) و OsTrx23 (C11S) تنها به فرم مونومر دیده شدند. فعالیت احیایی جهش‌یافته‌ها در واکنش با انسولین نیز تقریباً مشابه با پروتئین طبیعی بود. این نتایج نشان می‌دهد که Cys 3 و Cys 4 درانتهای آمینوی OsTrx20 و Cys 11 درانتهای آمینوی OsTrx23، نقشی کلیدی در دایمر شدن این پروتئین ها از طریق تشکیل باند‌های دی‌سولفیدی دارند. کلمات کلیدی : تیوردوکسین، جایگاه فعال، موتاسیون‌زایی هدایت شده، پایداری، دایمرشدن