سنتز نانوساختارهای کمپلکس پپتید-آنتی‌بادی بر پایه خودآرایی پپتید دی‌فنیل‌آلانین (FF)

STUDENT

DEGREE

YEAR

Newly self-assembly process is considered as a simple and practical way to use some of the material in biosensors and drug delivery. Self-assembly process is a process that lead to the emergence of spontaneous and controlled orderly molecular structures in two or three dimensions. One of these self-assembled materials is peptide D-phenylalanine (FF). Because of specific reactivity of antibodies to their antigens in the production of bio-sensors, they have been used regularly. For this purpose, the antibodies should be established on the electrode sensing device. If they had been established physically, it is possible that active sites which react with anti-female antibodies be unavailable. So regular fixation of antibody (Anti CD3 FITC) on the surfaces of gold, silicon and graphite crystal by using self-assembly of peptide D-phenylalanine on these surfaces is the subject of this study. First, we examined the self-assembly of peptides (FF) with diluted concentrations (2 mg per ml) and concentrated (100 mg per ml) of solvent (HFP) on the surfaces of gold, silicon and graphite and examined the stability of self-assembled peptide structures which formed on the surfaces to solvent by placing them inside the buffer () for 2 hours. Also, in addition to gold level of concentration, we examined the impact of the presence or absence of 3 and 4 thiol linker toluene on peptide's self-assembly and stability. To check self-assembly and stability of peptides on the surfaces, we used (SEM) analysis and obtained images indicate that regular formation of self-assembled peptide structures with acceptable surface increasing and good stability against solvents. Then by using the (FTIR) analysis, we discussed establishment of the linker peptide on the surface and junction of thiol group to the gold surface that results indicate the presence of the peptide on the surface and junction to the gold surface by using thiol linker group. In the second stage, after activation of antibody by using (EDC) and adding it to the peptide by using fluorescence microscopy and (FTIR) analysis, we investigated the activation and the presence of antibodies to the peptide that results indicate establishment of antibodies on peptide. In the final stage of the cycle, by using the potentiostat device and cyclic voltammetry analysis (CV), we discussed the stabilization of peptide and antibody on the gold surface's electrode and its efficiency in electrochemical processes for their use in biosensors. With the addition of concentrated peptide functionalized with thiol linker to the gold surface, maximum intensity decreased from 56 to 10 nano-amps current through it. With the addition of diluted peptide functionalized with thiol linker to the gold surface, maximum intensity decreased from 56 to 40 nano-amps current through it. These changes indicate that there is a vertical self-assembly of peptide concentration functionalized with thiol linker and horizontal self-assembly of peptide diluted functionalized with thiol linker, on the surface of gold. with the addition of antibodies to the self-assembled peptide concentration, maximum intensity decreased from 10 to 7 nano-amps current through it, which is 30 per cent change. with the addition of antibodies to the self-assembled peptide diluted, maximum intensity decreased from 40 to 15 nano-amps current through it, which is 62.5 per cent change. This is an expression of peptide-antibodies conjunction that due to greater resistance in the peptide concentration, with the addition of antibody resistance to that we have less decreased current compared to peptide diluted. Key words : peptide Di-L-phenylalanine, self-assembly, antibody, biosensor.

فرآیند خودآرایی فرآیندی است که به پیدایش خودبه خودی و در عین حال کنترل شده‌ی ساختارهای فوق منظم مولکولی در دو یا سه بعد منجر می شود. یکی از این مواد خودآرا شونده پپتید دی فنیل آلانین می‌باشد. به دلیل واکنش اختصاصی آنتی بادی‌ها با آنتی‌ژن خود، از آن ها به کرّات در تولید زیست حسگرها استفاده شده است. بدین منظور آنتی بادی می‌بایست بر روی الکترود دستگاه حسگر تثبیت شود. چنانچه این تثبیت بصورت فیزیکی انجام شود این امکان وجود دارد که سایت‌های فعال آنتی‌بادی برای واکنش با آنتی‌ژن در دسترس نباشند. تثبیت منظم آنتی بادی ضد آنتی‌ژن CD3 نشاندار شده با فلورسانس، بر روی سطوح طلا، سیلیکون و گرافیت با استفاده از خودآرایی پپتید دی فنیل آلانین (FF [1] ) موضوع این تحقیق است. ابتدا خودآرایی پپتید با دو غلظت رقیق (2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) و غلیظ (100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر ) در حلال هگزا فلئورو-2-پروپانول بر روی سطوح طلا، سیلیکون وگرافیت انجام شد. با هدف بررسی پایداری در برابر حلال، ساختارهای خودآرای پپتیدی تشکیل شده به مدت 2 ساعت داخل بافر فسفات قرار داده شدند. همچنین برای سطح طلا علاوه بر عامل غلظت، خودآرایی پپتید با لینکر و بدون لینکر تولوئن 3و4 دی تیول انجام شد. برای بررسی چگونگی خودآرایی و پایداری پپتید بر روی سطوح از آنالیز میکروسکوپ الکترون روبشی (SEM [2] ) استفاده شد. تصویرهای به دست آمده حاکی از تشکیل ساختارهای خودآرای پپتیدی با افزایش سطح قابل قبول و پایداری خوب در برابر حلال بودند که با تغییر فاکتورهایی مثل سطح، غلظت و عامل‌دار کردن پپتید با لینکر تیول مورفولوژی آن‌ها دستخوش تغییر می‌شد. با افزایش هیدروفوبی سطوح به ترتیب از طلا، گرافیت و سیلیکون، آرایش بیشتری از شاخه های منشعب نشان داده می‌شد و نواقص و ناخالصی‌های سطح نیز سبب تجمع خودآرایی در این نقاط می‌شد، به گونه‌ای که در حالت غلیظ برای سطح طلا نانولوله‌های عمودی و برای سطوح سیلیکون و گرافیت ساختارهای میکروکریستالی گل مانندی مشاهده شد. با کاهش غلظت آرایش عمودی نانوساختارها به سمت آرایش افقی میل پیدا می‌کرد که با توجه به شدت هیدروفوبی سطوح برای سطح طلا ساختارهای خطی طویل و مجزا و برای سطوح سیلیکون و گرافیت ساختارهای شاخه‌ای منشعب مشاهده شد البته برای سطح سیلیکون این نوع ساختارها با شدت بیشتری بود. قرار گرفتن سطوح دارای خودآرایی پپتید رقیق داخل بافر فسفات به منظور بررسی پایداری نانوساختارها، بیانگر تغییرخودآرایی پپتید به سمت تشکیل ساختارهای دندریمری بود، که اثر آب‌دوستی بافر فسفات سبب این امر شده بود. عامل‌دار کردن پپتید با لینکر تیول سبب میل پیدا کردن آرایش نانوساختارهای پپتیدی از نانولوله‌ها به سمت نانو وزیکول ها شده بود به گونه‌ای که طول لوله‌ها بسیار کوتاه‌تر و قطر و ضخامتشان بیشتر شد. در ادامه با استفاده از آنالیز دستگاه طیف سنج مادون قرمز (FT-IR [3] )، تثبیت پپتید بر روی سطوح و اتصال گروه تیول لینکر به سطح طلا بررسی شد که نتایج حاصل با توجه به حذف پیک پیوند S-H با فرکانس حدود (cm -1 )2500 نشان از حضور پپتید بر روی سطوح و اتصال پپتید به سطح طلا با استفاده از گروه تیول لینکر می‌داد. در مرحله‌ی بعد، بعد از فعال سازی آنتی بادی با استفاده از ماده ی ?-اتیل-?-(?-دی‌متیل‌آمینوپروپیل) کربودی ‌ایمید و اضافه شدن آنتی‌بادی به پپتید، با استفاده از دستگاه میکروسکوپ فلورسانس تثبیت و حضور آنتی بادی بر روی پپتید بررسی شد که نشر نور سبز حاکی از تثبیت موفق آنتی بادی بر روی پپتید بود. در مرحله ی آخر نیز با استفاده از دستگاه پتانسیواستات و آنالیز ولتامتری چرخه ای (CV [4] ) تثبیت پپتید و آنتی بادی بر روی الکترود سطح طلا و کارایی آن در فرآیند‌های الکتروشیمیایی جهت استفاده از آن ها در زیست‌حسگرها بررسی شد. با اضافه شدن پپتید غلیظ عاملدار شده با لینکر تیول به سطح طلا ماکزیمم شدت جریان عبوری کاهش یافته و از 56 به10 نانو آمپر می‌رسد. با اضافه شدن پپتید رقیق عامل‌دار شده با لینکر تیول به سطح طلا ماکزیمم شدت جریان عبوری کاهش یافته و از56 به 40 نانوآمپر می‌رسد. این تغییرات بیانگر خودآرایی عمودی پپتید غلیظ عامل‌دار شده و خودآرایی افقی پپتید رقیق عامل‌دار شده با لینکر تیول بر روی سطح طلا می‌باشد. در حالت غلیظ با اضافه کردن آنتی بادی ماکزیمم شدت جریان از 10 به 7 نانو آمپر می‌رسد که تغییر 30 درصدی را نشان می‌دهد. در حالت رقیق با اضافه کردن آنتی‌بادی ماکزیمم شدت از 40 به 15 نانو آمپر می‌رسد که تغییر 62.5 درصدی را نشان می‌دهد، که این بیانگر اتصال آنتی‌بادی به پپتید می‌باشد به نحوی که به دلیل مقاومت بیشتر در حالت غلیظ با اضافه شدن مقاومت آنتی بادی به آن افت شدت جریان کمتری را نسبت به حالت رقیق داریم.کلمات کلیدی: پپتید دی فنیل آلانین، خودآرایی، آنتی بادی، زیست حسگر