SUPERVISOR
بهرام شریف نبی (استاد راهنما) علیرضا جوادی اصطهباناتی (استاد مشاور)
STUDENT
Atefeh Karbasi najafabadi
عاطفه کرباسی نجف آبادی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1393
TITLE
A Taxonomic and Cross Inoculation Study of Colletotrichum spp. on Potato, Onion and Bean in Frieden City of Isfahan Province
Potato, onion and bean are important field crops that cultivated all around the worlds. These products have economical and nutritional importance, while potato is the most important dicots crops in human nutrition, bean is the most important legumes used by human. Also, onion is the fourth important vegetable crops cultivated in Iran. Fungi and other pathogens cause damages to these crops every year, while the damage caused by the fungus Colletotrichum might be wide spread in specific site. Colletotrichum . is causal agent of anthracnose disease. This disease in Isfahan province especially Fereydan city that has significant cultivation of these crops caused excessive damages. In this study, in order to identify and determine the possibility of cross contamination among pathogenic species of each host to another host, sampling was carried out from potato, onion and bean fields in Daran, Damaneh and Chadegan. regions Sampling was done from potatoes with symptoms such as wilting, acervul formation on crown, stem and root and finally threading crown of plant in late stages of the disease and onions with symptoms such as forming acervuls or black spots on crown and outer bulbs. The bean plants with symptoms such as leaf spot, root and crown rots and lesion and spot on pods and seeds also were collected More than 200 fungal samples were isolated which 170 belonged to Colletotrichum . After morphological examination, it was determined that 120 isolates belonged to C. coccodes in potato and 50 isolates belonged to C. circinans in onion. Although during sampling in two years from bean fields, no any Colletotrichum isolate wasn`t found. DNA of these fungi extracted by Murray and Thompson method and PCR reaction carried out by using primer pairs ITS1/ITS4. After sequencing and nucleotide blasting of isolates, the morphological results was confirmed. The results of blasting indicated that there were 100% identitiy of C. circinans and 99 to 100% identity of C. coccodes with available sequences in GenBank. Sequences alignment of the isolates showed 99 to 100% identity with sequences in database. Phylogenetic tree of ITS regions and 5.8 S sequens of Colletotrichum isolates with MEGA6 software confirmed molecular results. After 30 days of onion plants inoculation by C. circinans , the results indicated the pathogenicity of C. circinans on onion and no symptoms by inoculating on potato while after 60 days of potato inoculation by C. coccodes pathogenicity was confirmed on potato and no any symptoms on onion. Leaf inoculation of bean plants using 10 6 spore/ml of C. circinans and C. coccodes revealed no symptoms on bean leaves. As a results, it could be concluded that contamination of soil by C. coccodes and C. circinans in bean fields couldn't produce symptoms, while in potato field, presence of C. circinans couldn't produce disease symptoms and vice versa in onion by C. coccodes . The results might have a role in anthracnose disease control in potato, bean and onion fields. Keywords: Colletotrichum coccodes , Colletotrichum circinans , Potato, Onion, Cross inoculation.
سیب زمینی، پیاز و لوبیا از مهمترین گیاهان زراعی دنیا بوده و سطح زیر کشت قابل توجهی را به خود اختصاص داده اند این محصولات از اهمیت اقتصادی و تغذیه ای بالایی برخوردارند چنان که سیب زمینی مهمترین منبع دولپه ای در تغذیه انسان و لوبیا مهمترین محصول از دسته حبوبات جهان برای مصارف مستقیم انسان است. همچنین پیاز چهارمین محصول مهم از میان سبزیجات تولید شده در ایران می باشد. همه ساله تولیدکنندگان این محصولات، متحمل خساراتی ناشی از عوامل بیماری زای مختلف می شوند که از این بین سهم قابل توجهی از آلودگی در اثر عوامل بیماری زای قارچی می باشد. یکی از عوامل بیماری زایی که در مناطق کشت این محصولات، به خصوص مزارع سیب زمینی آلودگی و خسارات گسترده ای وارد می کند، قارچ Colletotrichum . عامل بیماری آنتراکنوز می باشد. این بیماری در استان اصفهان و بالاخص شهرستان فریدن که دارای سطح زیر کشت قابل توجهی از این محصولات است، خسارت زیادی وارد می آورد. در این پژوهش به منظور تشخیص، شناسایی و بررسی امکان ایجاد آلودگی تقاطعی بین گونه های بیماری زای هر میزبان با میزبان دیگر، از مزارع سیب زمینی، پیاز و لوبیای شهرهای داران، دامنه و چادگان نمونه برداری به عمل آمد. علائم بیماری در گیاهان سیب زمینی با علائم پژمردگی وخشکیدگی بوته، تشکیل آسرول روی طوقه، ساقه زیرزمینی و ریشه و ریش ریش شدن طوقه گیاه همراه بود. در مراحل آخر بیماری و روی فلس های خارجی پیاز سفید و گردن آن ها نقاط سیاه رنگ یا آسرول مشاهده شد. گیاهان لوبیای مشکوک به بیماری آنتراکنوز لکه برگی، پوسیدگی طوقه و ریشه، وجود زخم یا لکه روی غلاف و بذرها داشتند. پس از نمونه برداری از این میزبان ها در مزارع شهر فریدن، بیش از 200جدایه قارچی از سه میزبان مورد بررسی جداسازی شدکه از این بین 170 جدایه متعلق به Colletotrichum . بودند. پس از انجام بررسی های مورفولوژیک مشخص شد که 120 جدایه متعلق به گونه C . coccodes از سیب زمینی و 50 جدایه متعلق به گونه ی C. circinans از پیاز است، اما از گیاه لوبیا طی نمونه برداری در دو سال متوالی هیچ جدایه ای از جنس Colletotrichum جداسازی نگردید. پس از تایید مورفولوژیک گونه ها، DNA آن ها به روش موری و تامسون استخراج و با آغازگرهای ITS1 و ITS4 تحت واکنش PCR قرار گرفت. قطعه 580 جفت بازی در جدایه های مربوط به میزبان سیب زمینی و قطعه 509 جفت بازی در جدایه های مربوط به میزبان پیاز تکثیر شد. نتایج حاصل از بررسی های مورفولوژیک تایید شد. نتایج توالی یابی و بلاست آن ها نشان دهنده شباهت 100 درصدی جدایه های C. circinans و شباهت99 تا 100 درصدی جدایه های C. coccodes با توالی های موجود در بانک ژن بود. به این ترتیب نتایج حاصل از بررسی های مورفولوژیک تایید شد. همپوشانی توالی جدایه های بدست آمده با توالی های موجود در پایگاه داده نیاز 99 تا 100 درصد برآورد شد. رسم درخت تبارزایی حاصل از تعیین توالی نواحی ITS1 و ITS2 و ژن 5.8S جدایه های Colletotrichum با نرم افزار MEGA6 نتایج بررسی های مولکولی را تایید کرد. نتایج حاصل از اثبات بیماری زایی و تلقیح تقاطعی گونه های بدست آمده بیانگر آن بود که در پیاز سفید پس از گذشت یک ماه از زمان تلقیح با جدایه های گونه C. circinans علائم بیماری مشاهده می شد، اما تلقیح جدایه های C. coccodes )جدا شده از سیب زمینی( به بوته های پیاز موجب بروز هیچ علائمی در آن نشد. در رابطه با سیب زمینی، تلقیح جدایه های C. coccodes موجب ایجاد علائم بیماری گردید و بیماری زایی آن را اثبات کرد، اما جدایه های C. circinans )جدا شده از پیاز( هیچ گونه علائمی روی گیاه سیب زمینی ایجاد نکردند. گیاه لوبیا نیاز در اثر تلقیح با جدایه های C. coccodes و C. circinans هیچ علائمی نشان نداد. در نتیجه می توان گفت در اثر آلودگی خاک با گونه C. coccodes و کشت پیاز یا لوبیا در آن بیماری آنتراکنوز ناشی از این قارچ در این گیاهان بروز نخواهد کرد. به همین ترتیب اگر خاک با قارچ C. circinans آلوده باشد، درگیاهان لوبیا و سیب زمینی بیماری ناشی از این قارچ ایجاد نمی شود .این نتایج نشان داد که در صورت کاشت لوبیا در تناوب با سیب زمینی یا پیاز امکان بروز بیماری آنتراکنوز وجود نخواهد داشت.