Skip to main content
SUPERVISOR
سعید انصاری مهیاری (استاد راهنما) مرتضی دلیری (استاد راهنما) حمیدرضا رحمانی (استاد مشاور) ابوالفضل شیرازی (استاد مشاور)
 
STUDENT
Azadeh Zahmatkesh
آزاده زحمت کش

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1388

TITLE

Tracking of Filia Gene and Related Protein in Bovine Ovary and Oocyte
Filia is a maternal effect gene important for female reproduction. In the present study, bovine Filia expression was studied at mRNA and protein level. Oocytes were matured and fertilized and embryos were cultured to blastocyst stage. RNA were extracted from bovine ovary, oviduct, lung, heart, liver, 30- to 40-day fetus, immature oocytes, matured oocytes, 2-,4-, 8- to 16-cell embryos and blastocysts. Primers were designed to amplify 164 bp and 443 bp fragments. Bioinformatic analysis and a 3?RACE-PCR experiment were performed to analyze the whole Filia mRNA. A Real-Time PCR was performed to compare the mRNA level in different stages of in vitro development, with immature oocytes. Immunofluorescence analysis was performed on bovine ovary, oviduct and uterus. RT-PCR results showed that Filia transcripts are only detected in ovary, oocytes and different stages of embryo development. By 3?RACE-PCR only a 1600 bp fragment was amplified. Bioinformatic analysis indicated one transcription start site and three exons for Filia gene. Filia expression significantly increased at 8- to 16-cell stage which shows embryonic activation of Filia gene, and it decreased at blastocyst. Immunofluorescence showed Filia protein expression in bovine oocyte cytoplasm. We suggest an important role for Filia in bovine reproduction. Keywords: Bovine Filia gene, Oocyte, Blastocyst, RACE-PCR, Embryonic activation, Immunofluorescence.
فیلیا ( Filia ) یکی از ژن های مادری است که بر نرخ باروری موثر است و اختلال در عملکرد آن منجر به اختلالات تولید مثلی در حیوان ماده می شود. پروتئین فیلیا در موش باعث تفکیک مناسب کروموزوم ها در رویان می شود و همچنین در یک مجموعه ی پروتئینی در ناحیه ی زیر کورتکسی تخمک و رویان موش حضور دارد که بر تکامل رویانی موثر است. تاکنون بیان فیلیا در موش، انسان و گوسفند بررسی و گزارش شده است ولی در گاو اطلاعاتی در دسترس نیست. در این تحقیق به کمک محیط کشت بهینه سازی شده برای کشت آزمایشگاهی رویان گاو جهت تامین منابع استخراج RNA، بیان ژن فیلیا در سطح mRNA مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور، تخمک ها از تخمدان های گاوهای کشتارشده جمع آوری شد و تعدادی از آن ها به صورت آزمایشگاهی بالغ شد. از این تعداد بخشی وارد مرحله ی لقاح آزمایشگاهی شد و در نهایت در محیط های کشت یک و دو مرحله ای بهینه سازی شده با 100 نانوگرم در میکرولیتر مکمل EGF تا مرحله ی بلاستوسیست کشت داده شد. استخراج RNA از تخمدان، اویداکت، شش، قلب، کبد و جنین 40-30 روزه ی گاو، تخمک نابالغ، تخمک بالغ شده، رویان های دو، چهار و هشت تا 16 سلولی و بلاستوسیست انجام شد. انتهای?5 توالی پیش بینی شده ی رونوشت فیلیا در NCBI با توالی مشابه آن در انسان بلاست گذاشته شد و طراحی آغازگر از روی ناحیه ی حفاظت شده ی آن برای تکثیر یک قطعه با 164 جفت باز صورت گرفت. همچنین آغازگر دیگری برای تکثیر 443 جفت باز از بخش داخلی تری از رونوشت فیلیا طراحی شد. واکنش PCR به کمک آغازگرهای طراحی شده برای فیلیا و نیز ژن خانه دار Histone H2a در بافت ها، تخمک و رویان های مراحل مختلف انجام شد و نتایج الکتروفورز ژل ها به صورت تصویر ثبت و قطعه ی مورد نظر تعیین توالی شد. برای تعیین اندازه ی کل توالی رونوشت فیلیا، بررسی بیوانفورماتیک روی توالی فیلیا و آزمایش 3?RACE-PCR انجام شد. جهت مقایسه ی کمی میزان بیان در مراحل مختلف تخمک و رویان، آزمایش Real-Time PCR صورت گرفت. برای بررسی بیان پروتئین فیلیا، ابتدا توالی تعیین شده ی رونوشت فیلیا به پروتئین ترجمه شد و تعداد 15 اسید آمینه از انتهای آمینی آن سنتز و با KLH کانژوگه شد. برای تولید آنتی بادی علیه پروتئین فیلیا، پپتید مورد نظر در یک برنامه ی زمانی دوماهه به خرگوش تزریق شد و خون گیری پیش از تزریق اولیه و پس از تزریق نهایی انجام شد. سرم به کمک آزمایش های دات بلات و الایزا برای تعیین اختصاصیت تشخیص پروتئین فیلیا مورد تایید قرار گرفت. برای آزمایش ایمونوفلورسنس، بافت های تخمدان، اویداکت و رحم گاو و همچنین تخمدان گوسفند به آزمایشگاه منتقل و پس از فرآوری به ضخامت پنج میکرو متر برش داده شد و روی اسلاید قرار گرفت. آزمایش ایمونوفلورسنس با غلظت 1:300 آنتی بادی اولیه علیه فیلیا انجام شد و نتایج به کمک میکروسکوپ فلورسنت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج RT-PCR نشان داد که نسخه های فیلیا تنها در تخمدان و مراحل مختلف تکاملی از تخمک نابالغ تا رویان در مرحله ی بلاستوسیست وجود دارد. واکنش 3?RACE-PCR نشان داد که تنها یک قطعه با 1600 جفت باز تکثیر شد و هیچ قطعه ی کوچک تری مشاهده نشد. بررسی ژن فیلیا و پروموتر فرضی آن نشان داد که تنها یک جایگاه شروع رونویسی در نوکلئوتید 94- بالادست کدون آغاز قرار دارد و این ژن دارای سه اگزون است و احتمال می رود که mRNA فیلیای گاو تنها یک واریانت داشته باشد. این نتایج، اختلافات میان نشخوارکنندگان و جوندگان را نشان می دهد. بیان ژن فیلیا در مرحله ی بلوغ نسبت به قبل بلوغ کاهش و در مراحل دو و چهارسلولی افزایش یافته است ولی این تغییرات از نظر آماری معنی دار نبود. بیان ژن در مرحله ی هشت تا 16-سلولی به طور معنی داری افزایش و در مرحله ی بلاستوسیست با نسبت قابل توجهی کاهش پیدا کرد. افزایش بیان در مرحله ی هشت تا 16-سلولی، بیان رویانی فیلیا و نیاز بحرانی رویان را به این نسخه در تقسیم چهارم سلولی نشان می دهد. آزمایش های دات بلات و الایزا اختصاصیت عملکرد آنتی بادی تولید شده را تایید کرد. بررسی ایمونوفلورسنس روی بافت ها نشان داد پروتئین فیلیا تنها در سیتوپلاسم تخمک فولیکول های تخمدان گاو بیان می شود و در گوسفند، بیان آن به ناحیه ی زیر کورتکسی تخمک محدود می شود. با توجه به این که پروتئین فیلیا در موش باعث تفکیک مناسب کروموزوم ها در رویان می شود و بر باروری موثر است، احتمال می رود این پروتئین نقش مشابهی نیز در نشخوارکنندگان داشته باشد. واژه های کلیدی: ژن فیلیای گاو، تخمک، بلاستوسیست، بیان رویانی، ایمونوفلورسنس

ارتقاء امنیت وب با وف بومی