SUPERVISOR
Amir Massah,Aboozar Soorni,Nafiseh Poorjavad
امیر مساح (استاد راهنما) ابوذر سورنی (استاد مشاور) نفیسه پورجواد (استاد مشاور)
STUDENT
Sajedeh Khalili
ساجده خلیلی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1396
TITLE
Transmission, host range and certain molecular properties of cynodon chlorotic streak virus
Non-crop plants of the Poaceae family mainly perennial weed species such as Bermuda grass (Cynodon dactylon), are host of several viruses and can act as reservoir hosts for them. Therefore, the study of viruses in weed is a critical step in the control of viruses. Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) has been reported to infect Bermuda grass and corn. The virus belongs to the familyRhabdoviridaeand the genuucleorhabdoviruand is transmitted byToya propinquain a circulative-propagative manner. To detect CCSV, Bermuda grass samples with chlorotic streaks symptoms on leaves were collected from Isfahan, Chaharmahal-va-Bakhtiari, and Fars provinces. In the RT-PCR technique, using the universal primer pair of rhabdoviruses (RhabF / RhabR), the expected size of the PCR product (970 bp) was amplified in the samples. In the BLAST search, the sequence of the amplified segment showed high degree of homology to an isolate of CCSV reported from South Africa available at GenBank with the accession number of EU650683.1. To determine the nucleotide sequence of the Iranian isolate of CCSV (CCSV-IR), total RNA was extracted, and its quantity, purity, and quality was evaluated using spectrophotometry and electrophoresis. Total RNA was sent for RNA sequencing. RNA-Seq analysis showed that CCSV-IR has six genes on its genome same other nucleorhabdoviruses as 3'-N-P-Gene 3-M-G-L-5'. Multiple alignment based on the nucleotide and amino acid sequences of CCSV-IR genes and those of other rhabdoviruses available at GenBank using DNAMAN 4.0 and CLC Viewer softwares was done. Multiple alignment showed CCSV-IR has the highest similarity to maize Iranian mosaic virus (MIMV), Morogoro maize-associated virus (MMaV), taro vein chlorosis virus (TaVCV), and maize mosaic virus (MMV) as 75 %, 63.9 %, 62.4 %, and 62.2 %, respectively. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequence of the L gene of CCSV-IR and those of other rhabdoviruses with Neighbor-joining method revealed CCSV-IR is closer to MIMV than other nucleorhabdoviruses. For determination of genetic variation of Iranian isolates of CCSV, the 970 bp segment of five isolates, including CCSV-IR and CCSV-Esf from Isfahan, CCSV-Fra from Fraidan CCSV- Sha from Shahrekord, and CCSV-Shi from Shiraz were sequenced. Multiple alignment of the amino acid sequence of 970 bp of CCSV Iranian isolates using DNAMAN 4.0 software with the Neighbor-joining method revealed high identity amongst Iranian isolates ranging from 95.3 %-99.2 %. For determining the host range of CCSV, in transmission test includingAvena sativa, Triticum sativum, Oryza sativa, Hordeum vulgare, Zea mays, Sorghum bicolor, Secale montanum, Panicum miliaceum, Bromus tectorum, Secale sp. Hordum murinumandCynodon dactylon,Toya propinquatransmitted CCSV from infected Bermuda grass toHordeum vulgare, Zea mays, Avena sativa,andCynodon dactylon. Our results showed that the closest virus to CCSV-IR is MIMV. Due to transmission of CCSV to essential plants such as barley and corn and abundance of its vectorT. propinquain nature, it seems that CCSV can infect cereals in nature and damage them. Therefore, detection of CCSV in graminaceous plants in nature and estimation of its risk in the future researches should be considered. Key words: Nucleorhbdovirus, cynodon chlorotic streak virus, Host range, genome sequence.
گیاهان غیر زراعی تیره غلات به ویژه گونه های چند ساله مانند مرغ، میزبان تعداد زیادی از ویروس های گیاهی هستند. به دلیل کوتاه بودن عمر اکثر گیاهان زراعی، وجود گیاهان وحشی یا علف های هرز برای بقا اکثر ویروس ها یک ضرورت حتمی و اساسی می باشد. به همین دلیل مطالعه ویروس های موجود در علف های هرز می تواند نقش مهمی در کنترل ویروس های بیماری زای غلات داشته باشد. درسال 1985 برای اولین بار ویروس رگه سبزرد مرغ cynodon chlorotic streak virus (CCSV) از روی گیاهان مرغ و ذرت گزارش شد. به منظور ردیابی ویروس رگه سبزرد مرغ، گیاهان مرغ دارای علائم خطوط سبزرد و رنگ پریده از استانهای اصفهان، چهارمحال و بختیاری و فارس جمع آوری شدند. پس از استخراج آر. اِن. اِی کل، با استفاده از تکنیک RT-PCR و جفت آغازگر عمومی رابدوویروس ها (RhabF/RhabR) حضور باند مورد نظر bp 970 در نمونهها تکثیر گردید وآلودگی چهل عدد از نمونه های جمع آوری شده به یکی از اعضای رابدوویروس ها تائید شد. بررسی توالی قطعه تکثیر شده با استفاده از نرم افزار BLAST نشان دهنده شباهت بالای آن با توالی جدایه ای از CCSV گزارش شده از آفریقای جنوبی موجود در بانک ژن با رس شمار EU650683.1 بود. به منظور تعیین توالی نوکلئوتیدی ژنوم جدایه ایرانی ویروس رگه سبزرد مرغ CCSV-IR و مقایسه آن با سایر رابدوویروسهای گیاهی موجود در بانک ژن، آر. اِن. اِی کل ، یک نمونه شاخص استخراج گردید و به روش RNA-seq توالی یابی شد. بررسی توالی های حاصل از RNA-seq وجود شش ژن را در CCSV-IR مشخص کرد. همردیف سازی چند تائی و آنالیز تبارزائی بر اساس توالی نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی هر یک از ژن ها بین CCSV-IR و دیگر رابدوویروسهای موجود در بانک ژن با استفاده از نرم افزار DNAMAN ver. 4.0 و CLC viewer انجام گردید. همردیف سازی چند تائی نشان داد جدایه ایرانی ویروس رگه سبزرد مرغ بیشترین شباهت را با ویروس موزائیک ایرانی ذرت (MIMV) maize Iranian mosaic virus دارد. بر اساس توالی آمینو اسیدی ژن پلی مراز، CCSV-IR بیشترین شباهت را با MIMV،,morogoro maize associated virus taro vein chlorosis viru و maize mosaic virus به ترتیب به میزان 75 % ، 9/63 % ، 4/62 % و 2/62 % دارا می باشد. در ترسیم درخت تبارزایی، CCSV-IR با MIMV در یک گروه قرار گرفت. به نظر می رسد با توجه به میزان تشابه بالای CCSV-IR با MIMVو قرار گرفتن آن ها در یک گروه این دو ویروس دارای یک نیای مشترک باشند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی CCSV، بخشی از ژن پلی مراز پنج جدایه CCSV شامل دو جدایه از اصفهان (CCSV-IR) و (CCSV-Esf)، یک جدایه از فریدن(CCSV-Fra)، یک جدایه از شیراز(CCSV-Shi) و یک جدایه از شهرکرد (CCSVS-Sha) توالی یابی شدند. همردیف سازی چند تایی نشان دهنده بیش ترین درصد تشابه در بین جدایه های ایرانی، بین دو جدایه CCSV-IR و CCSV-Esf از اصفهان به میزان 2/99 درصد و کمترین درصد تشابه بین جدایه CCSV-Shi از شیراز با جدایه CCSV-Fra از فریدن به میزان 3/95 درصد بود. در تعیین دامنه میزبانی CCSV-IR، انتقال ویروس با زنجرک ناقل Toya propinqua به یولاف، جو و ذرت تائید شد. بر اساس نتایج حاصل از این تحقیق، نزدیک ترین ویروس به CCSV-IR ویروس موزائیک ایرانی ذرت می باشد. با توجه به آلوده شدن گیاهان مهمی مانند جو و ذرت به CCSV-IR به نظر می رسد به دلیل فراوانی ناقل آن در طبیعت، این ویروس پتانسیل آلوده کردن این گیاهان در طبیعت و ایجاد خسارت بر روی آن ها را نیز داشته باشد. به همین دلیل لازم است تحقیقات مربوط به ردیابی این ویروس در گیاهان زراعی خانواده پوآسه و برآورد میزان خطر آن در این گیاهان ادامه داشته باشد. کلمات کلیدی: نوکلئورابدوویروس، ویروس رگه سبزرد مرغ، دامنه میزبانی، توالی ژنوم