SUPERVISOR
Kayghobad Shams
کیقباد شمس اسحاقی (استاد راهنما)
STUDENT
Afsaneh Goortanian njad
افسانه گورتانیان نژاد
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده مهندسی شیمی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1390
TITLE
Chicken Liver Alcohol Dehydrogenase Extraction and Enrichment using Microbubbles (Aphrons)
Plant tissues and animal organs are the most important sources of enzymes in the growing field of enzyme biotechnology. About 70% of the enzymes are extracted from plant tissues or exudates and animal organs. Animal derived enzymes represent about 10% of the total enzyme market. Alcohol dehydrogenases (ADH) are a group of dehydrogenase enzymes that occur in many organisms and facilitate the interconversion between alcohols and aldehydes or ketones . It is believed that chicken liver is a good source of ADHs. Therefore, in the present study, chicken liver was selected as an affordable, accessible, animal organ, which is rich in a vast variety of enzymes, including ADH, and the goal of this study was extraction and enrichment of ADH from chicken liver. Recovery and purification of biological products is a complex process that usually its production cost is relatively higher than the normal commodities and goods. In recent years, the production of new proteins in the biotechnology industry, using simple and inexpensive separation methods has attracted much attention. Conventional protein purification processes are multistep processes that involve a significant loss of enzyme activity. One of the promising methods for enzyme separation and enrichment is foam fractionation. It is believed that separation of proteins using foam would minimize the separation steps, and would maintain satisfactory purification efficiency. In this method, generated bubbles in the solutions that contain surfactants and enzymes create a gas - liquid interface that adsorb the active substances. Micron size bubbles called “aphrons” have shown a good potential for separation of enzymes with high efficiency. This is because of the fact that aphrons would enhance the transfer of the enzyme to the aphron phase by increasing the gas-liquid interface through reduced bubble size and as a result increased specific mass transfer area. So, in this research project micro bubbles were used for the extraction and enrichment of ADH enzyme. In order to produce bubbles, ultrasonic homogenizer at various speeds and in different time spans was used to agitate and blend the surfactant-containing aqueous solutions. Then, a certain volume of bubbles was mixed with solution containing the enzyme mixture and enough contact time was spared for enzyme isolation. To investigate the effects of mixing and surfactant on possible enzyme denaturation of the isolated enzymes, electrophoresis was used. Enzyme concentration was determined via light absorption of UV and Beer-Lambert correlation was used to calculate the enzyme concentration. The results showed that the type and concentration of the surfactants, pH, and the presence of salts had profound effects on enrichment. At first, experiments were performed using anionic and cationic surfactants and finally AOT was selected as the best surfactant. The salts used for extraction were KCl and NaCl. Results showed that in the presence of KCl and at a concentration of 6 mM AOT and at a pH value of 6, smaller bubbles were generated, and the highest enrichment yield was obtained (238.9 %). Measured bubble sizes using light microscope were about 10-100 micrometer. Experimental observations indicated that generation of nano-sized bubbles in presence of KCl would be plausible; however, because of the unavailability of suitable measuring devices, identification of nanobubbles was not explored. In addition, electrophoresis results confirmed the enrichment, and indicated that the isolated Alcohol Dehydrogenases were not denatured.
بافتهای گیاهی و اندامهای حیوانی از جمله مهمترین منابع آنزیمی در بیوتکنولوژی آنزیم ها هستند. حدود 70% آنزیم ها از این منابع استخراج شده اند و آنزیم هایی که از اندامهای حیوانی بدست می آیند درحدود 10% کل آنزیم های موجود در بازار است. بر این اساس در این پروژه جگر مرغ به عنوان منبع آنزیمی ارزان قیمت، در دسترس و غنی از آنزیم ها، برای جداسازی آنزیم الکل دی هیدروژناز انتخاب شد. احیا و خالص سازی محصولات بیولوژیکی معمولاً با فرآیند های پیچیده ای همراه است که هزینه آن حتی از 70% قیمت نهایی محصول بالاتر است. در سالهای اخیر با تولید پروتئین های جدید در صنعت بیوتکنولوژی ، روشهای جداسازی ساده و ارزان قیمت مورد نیاز است. روند مرسوم خالص سازی پروتئین شامل عملیات چند مرحله ایست که با تلفات قابل ملاحظه ای از فعالیت آنزیم همراه است. روند مورد استفاده در این تحقیق جداسازی ازطریق کف است که ضمن حداقل سازی مراحل فرآیند، بازده خالص سازی را حفظ می کند. در این روش با ایجاد حباب در محلول حاوی مواد فعال سطحی و آنزیم مورد نظر، یک سطح مشترک گاز- مایع ایجاد می شود که مواد فعال جذب سطحی این فصل مشترک می شوند. انتقال پروتئین به فاز کف با کوچک شدن اندازه حبابها، افزایش می یابد و این ناشی از سطح مشترک بیشتر و افزایش غلظت پروتئین جذب شده است. در جداسازی های بیومولکولی، حباب های بسیار کوچک، اصطلاحا" افرون "، ویژگی های استخراجی خوبی را نشان داده اند. بنابراین در این پروژه از میکرو حبابها جهت استخراج و غنی سازی آنزیم مورد نظر استفاده شد. به منظور تولید حباب ، محلول حاوی مواد فعال سطحی به وسیله همزن فراصوت با دور موتور مورد نظر و در زمان مشخص هم زده شد. سپس حجم معینی از حباب ها با محلول حاوی آنزیم مخلوط شد و پس از گذشت زمان مشخصی جداسازی شد. برای بررسی بی تاثیری مواد فعال سطحی بر روی ماهیت آنزیم ، از الکتروفورز استفاده گردید. میزان آنزیم غنی سازی شده نیز با استفاده از روابط و میزان جذب نور در دستگاه UV محاسبه شد. نتایج بدست آمده نشان داد که بسته به نوع و غلظت ماده فعال سطحی، pH و حضور نمک، بازده غنی سازی متفاوت بود. ابتدا آزمایش ها با استفاده 3 نوع ماده فعال سطحی آنیونی و کاتیونی صورت گرفت که در پایان و با توجه به نتایج بهترین ماده فعال سطحی، ماده فعال سطحی آنیونی AOT ، انتخاب شد. نمک های مورد استفاده نیز KCl و NaCl بودند که آزمایش ها نشان داد در حضور KCl و در غلظت 6 میلی مولار AOT و در 6 pH= علاوه بر اینکه می توان حباب های کوچکتری تولید کرد، بالاترین بازده غنی سازی نیز بدست آمد که نسبت به حالت 1/0 میلی مولار AOT و در غیاب نمک و در 6 pH=، بازده غنی سازی 4/2 برابر بود. حباب های تولیدی قابل اندازه گیری در حدود 10-100 میکرومتر بود و احتمال ایجاد نانو حباب در حضور نمک KCl وجود داشت که به دلیل در دسترس نبودن وسایل اندازه گیری مناسب، امکان شناسایی نانو حباب ها فراهم نشد. بررسی از طریق الکتروفورز نیز عملکرد غنی سازی و عدم تغییر ماهیت الکل دی هیدروژناز از طریق AOT را تایید کرد. واژه های کلیدی : الکل دی هیدروژناز، غنی سازی، افرون ، الکتروفورز